Długotrwałe utrzymywanie się jąder dawców u pacjentów z dystrofią mięśniową Duchennea otrzymujących przeszczep szpiku kostnego ad 5

Po zbadaniu, klastery miofibrów dodatnich pod względem dystrofiny obserwowano u wszystkich pacjentów, bez widocznej różnicy między skrawkami z DMD-BMT1 i nieransplantowaną pacjentką DMD Dl (Figura 3, d. F) i D2 (dane nie pokazany). Skrawki zabarwione MANDYS102 rozpoznające epitop białka w eksonie dystrofiny 43 (43, 44) (Figura 3, a i d) lub CAP6-10 rozpoznające epitopy białkowe w eksonach dystrofiny 42. 64 (38) (Figura 3, c i f) ujawnione słaba reaktywność dystrofiny w większości mięśniaków i silna reaktywność w zdyspergowanych, zgrupowanych miowłókienkach, które również wydawały się dodatnie z MANEX46B, Ab specyficznym dla epitopu białka w egzonie 46 dystrofiny 46 (Figura 3, b i e). Nie stwierdzono wykrywalnej różnicy w wybarwieniu dystrofiny pomiędzy nieransplantowanymi kontrolami a DMD-BMT1. Figura 3 Analiza immunohistochemiczna / FISH na odcinkach seryjnych z biopsji mięśnia DMD-BMT1 (a. C) i D1 (d. F). Liczby w panelach a-c identyfikują określone miofibry w odcinkach szeregowych; 7 i 7. reprezentują podzielonego myofibera. (a (af) Sekcje tkanek barwione różnymi Ab z dystrofiną wykazują obecność miofibrów dystrofino-dodatnich (sygnał zielony). (g. i) Czterokolorowa analiza FISH / immunohistochemiczna do wykrywania połączonych diploidalnych jąder donorowych w sekcjach tkanki mięśniowej DMD-BMT1. DMD-BMT1 (g i h) i nietknięte kontrolne odcinki żeńskie (i) żeńskie zabarwione na dystrofinę (magenta), a następnie hybrydyzowane przez FISH z sondą X-centromerową (zielony) i sondą egzonową dystrofiny 45 (czerwony). Jądra są barwione kontrastowo na niebiesko przez DAPI. ex, egzon. Analiza FISH fragmentów tkanek DMD-BMT1 o barwie immunologicznej z użyciem sondy DNA eksonowej dystoniny 45 (czerwone) i sondy centromerowej chromosomu X (zielony) ujawniła obecność diploidalnych jąder donorowych połączonych w miofibry dystrofiny (magenta) z pojedynczą zieloną i czerwoną sygnały hybrydyzacji (Figura 3, g i h). Fragmenty tkanki od niezakażonej samicy ujawniły oczekiwany podwójny zielony i czerwony sygnał hybrydyzacji w 63% jąder (Figura 3i). Analiza FISH na skrawkach tkanki mięśniowej z D1 lub D2 nie pozwoliła wykryć egzonu 45 dystrofiny (dane nie przedstawione). Ponieważ DMD-BMT1 jest chimerą krwiotwórczą, w której limfocyty T i NK pochodzą od dawcy, ważne było ustalenie, czy jądra pochodzące od dawcy wykryte w miofibry dystrofino-dodatnich wynikały z artefaktycznego nałożenia się limfocytów T lub inkorporacji jąder donorowych. w hostii myofiber. Jednoczesne barwienie immunologiczne dystrofiny i białka CD2 specyficznego dla limfocytu T nie wykazało dowodów, że limfocyty T dawcy połączyły się z miofibrantami gospodarza. Zamiast tego, limfocyty T wykryto tylko śródstopniowo w dwóch oddzielnych seriach seryjnych odcinków obejmujących całkowitą długość 700 .m (Figura 4, aib). Analiza FISH 11 z tych kolejnych odcinków z użyciem sondy kosmidowej dystonu exon 45 ujawniła osiem śródmiąższowych limfocytów T pochodzących od dawcy (figura 4c), osiem jąder donorowych połączonych w obrębie miofibry dystrofino-pozytywnych pozbawionych markera limfocytu T CD2 (fig. 4, d. F ) i dwa jądra donorów poddane fuzji w mięśniakach z dystrofią ujemną. Rycina 4 Barwne analizy FISH / immunohistochemiczne do kodekowania jąder pochodzących od dawcy, komórek T i miofibrów dodatnich pod względem dystrofiny w mięśniu DMD-BMT1. Komórki T są zabarwione na zielono (FITC), miofibry dystrofino-dodatnie barwione są w magenta (Cy5), jądra są wybarwione na niebiesko (DAPI), a jądra dawcy mają czerwony sygnał hybrydyzacji (rodaminę). (a i b) limfocyty T nie są skondensowane z miofibrami dodatnimi pod względem dystrofiny, ale wydają się znajdować między miamilami. (c) limfocyty T są pochodzenia donorowego, jak pokazano przez sygnał hybrydyzacji eksonu 45 dystrofiny 45 po analizie FISH (biała strzałka) (df) Jądra donorowe połączone z mięśniakami dystrofilnymi dodatnimi nie są komórkami T (białe groty strzałek). Analiza transkryptów mRNA za pomocą RT-PCR. W celu zbadania na poziomie molekularnym przeprowadzono typ (y) transkryptów dystrofin wyrażanych w mięśniu DMD-BMT1, zagnieżdżone analizy RT-PCR. W pierwszej rundzie amplifikacja cDNA przy użyciu starterów swoistych dla eksonów dystrofiny 42a48 ujawniła obecność pasma o przewidywanej wielkości od nie kontrolowanej kontroli i pasma o zmniejszonych rozmiarach z DMD-BMT1, D1 i D2 (dane nie przedstawione). Reamplifikacja rozcieńczonych produktów PCR z użyciem zagnieżdżonych starterów C43F-C48R lub C43F-C47R ujawniła obecność wielu pasm (Figura 5a), które oczyszczono i zsekwencjonowano. Największy prążek odpowiadał transkrypcji pozbawionej egzonu 45 (poza ramką), podczas gdy mniejsze prążki były zgodne z transkryptami albo pozbawionymi eksonów 44 i 45, albo eksonów 45, 46 i 47, odpowiednio (Figura 5b). Oczekuje się, że te transkrypty będą eksprymować w ramce, skrócone białka dystrofiny 43. 46 i 44. 48 (24, 45).
[więcej w: sklep pszczelarski łysoń, klinika stomatologiczna łódź, podchloryn sodu dawkowanie ]
[patrz też: dom latających sztyletów cda, depilacja brazylijska poznań, czym słodzić zamiast cukru ]