Długotrwałe utrzymywanie się jąder dawców u pacjentów z dystrofią mięśniową Duchennea otrzymujących przeszczep szpiku kostnego ad 6

Liczne słabe prążki wykryto także w pobliżu oczekiwanej masy cząsteczkowej dystrofiny pełnej długości w DMD-BMT1 (Figura 5a). Te prążki zostały również oczyszczone, ale analiza sekwencji nie pozwoliła ustalić, czy te transkrypty odpowiadają dystrofinie pełnej długości. Figura 5 Analiza transkryptów dystrofin wyrażanych w mięśniach DMD-BMT1. (a) U43a 47 to kontrolny cDNA kontrolowany bez wpływu na startery C43F-C47R; D43a47 i D43a48 to cDNA DMD-BMT1 zamplifikowane przy użyciu odpowiednio starterów C43F-C47R lub C43F-C48R. D43-48 pokazuje obecność trzech transkryptów: del45 (655 pz), 43-46 (507 pz) i 44-48 (357 pz). (b) Schemat schematu transkryptów dystrofin amplifikowanych za pomocą RT-PCR i zsekwencjonowanych w DMD-BMT1. WT, typ dziki. (c) Amplifikacja pełnej długości dystrofiny pochodzącej od dawcy w DMD-BMT1 (D43. 45, D45. 46) i w niezakażonej kontroli (U43. 45, U45. 46). (d) Ilościowa analiza RT-PCR całkowitego cDNA pochodzącego z mięśnia szkieletowego DMD-BMT1. CDNA amplifikowano za pomocą starterów specyficznych dla izoformy 45del (ciemnoniebieski), 44-48 w skrócie dystrofiny w ramce (jasnoniebieski), 43-46 obciętej dystrofiny w ramce (różowy) i dystrofiny typu dzikiego (zielony). . Rn,. odczyn. W celu wykrycia transkryptów dystrofiny typu dzikiego w DMD-BMT1, przeprowadzono pierwszą rundę amplifikacji PCR przy użyciu starterów CC42F-CC45R lub CC45F-C47R, a następnie zagnieżdżono amplifikację PCR przy użyciu starterów C43F-CC45R lub CC45F-C46R. Prążki o oczekiwanej wielkości zawierające ekson 45 zostały zamplifikowane z kontroli nienaruszonej i DMD-BMT1 (Figura 5c). Przeciwnie, amplifikacja cDNA z D1 i D2 przy użyciu starterów CC42F-CC45R nie powiodła się w celu wzmocnienia prążka, co potwierdza, że ekson 45 dystrofiny 45 jest usuwany u tych pacjentów (dane nie przedstawione). Aby oszacować względne ilości transkryptów dystrofiny obecnych w mięśniu DMD-BMT1, przeprowadziliśmy ilościową analizę RT-PCR w czasie rzeczywistym (Figura 5d). Najobficiej występującym cDNA dystrofiny w mięśniu DMD-BMT1 jest eks- presja usuniętego ekson 45a, a następnie izoformy skrócone w 43 ° 46 i 44 p48 (Figura 5d). Istnieje wykrywalna dystrofina pełnej długości w DMD-BMT1 w szacunkowej ilości 0,0005% w stosunku do normy (Figura 5d). Podobną ilość normalnych transkryptów dystrofiny wykrywano w cDNA pochodzącym z limfocytów krwi obwodowej osobnika nie dotkniętego chorobą (dane nie przedstawione), co utrudnia wykluczyć, że transkrypty dystrofiny typu dzikiego w DMD-BMT1 są wytwarzane przez skondensowane jądra dawcy lub przez limfocyty T pochodzące z dawcy śródmiąższowego. Żadne transkrypty dystrofiny typu dzikiego nie były amplifikowane z cDNA pochodzącego z mięśni D1 lub D2 (dane nie pokazane). Dyskusja Badania na gryzoniach wykazały, że BM zawiera komórki progenitorowe dla linii krwiotwórczych i niehematopoetycznych (9, 11, 12, 13, 46), w tym mięśnie szkieletowe (30 32). Podobnie, ludzkie komórki BM mogą dać początek hepatocytom (18, 47, 48), kardiomiocytom (19), osteocytom (5, 6) i komórkom nabłonkowym in vivo po BMT (18). DMD-BMT1 ma bardzo łagodny przebieg kliniczny DMD, który skłonił nas do zbadania, czy BMT, który otrzymał w leczeniu X-SCID, spowolnił również progresję objawów DMD poprzez fuzję komórek dawcy w miofibry dystroficzne, czego wynikiem jest ekspresja dzikiego typ dystrofiny. Nasze analizy pokazują, że stosunkowo łagodny przebieg kliniczny DMD-BMT1 prawdopodobnie nie wynika z BMT, ale z pominięcia egzonu i ekspresji skróco- wanego białka dystrofiny. Analizy molekularne wykazały, że DMD-BMT1 odziedziczył delecję eksonu 45 dystrofiny od matki i że nie jest mozaiką somatyczną do delecji. Zatem analiza FISH z zastosowaniem sond egzonowych dystrofiny jednoznacznie wykrywa obecność jąder pochodzących od dawcy w tkankach otrzymanych z DMD . BMT1. W przeciwieństwie do sondy centromerowej z chromosomem X wykrywają ją komórki pochodzące od dawcy i od gospodarza. Analiza FISH biopsji mięśni z DMD-BMT1 wykazała, że jądra pochodzące od dawcy zostały połączone z miofibry-mi dodatnimi pod względem dystrofiny. Jądra te były diploidalne i nie stały się tetraploidalne in vivo poprzez fuzję z jądrami gospodarza (20). Kodetek eksonu 45 dystrofiny 45 przez FISH i marker specyficzny dla limfocytu T CD2 wykazały, że większość komórek T w mięśniu DMD-BMT1 pochodzi od dawcy, jak oczekiwano od BMT. Analiza ta sugeruje również, że jądra dawcy połączone w miofibry dystrofino-dodatnie raczej nie będą przypadkowymi komórkami T leżącymi na myofiberu gospodarza, ponieważ nie wyrażają CD2. Jednak wyniki te nie wykluczają całkowicie możliwości, że limfocyt T pochodzący od dawcy połączony z myofiberiem gospodarza obniżył następnie ekspresję CD2. Obecność połączonych jąder, które pochodzą z transplantowanych komórek BM dawcy, sugeruje istnienie w dorosłym ludzkim BM komórki prekursorowej, która ma zdolność do połączenia w dojrzałe mięśnie szkieletowe in vivo.
[hasła pokrewne: wieniec zdrój sanatorium hutnik, gorvita zielony jęczmień opinie, bartnik bielsko ]
[przypisy: jak zakończyć karmienie piersią, płatki owsiane na wodzie, podchloryn sodu dawkowanie ]