Długotrwałe utrzymywanie się jąder dawców u pacjentów z dystrofią mięśniową Duchennea otrzymujących przeszczep szpiku kostnego ad

Dla każdej reakcji PCR, 300 ng starterów do przodu lub do tyłu dodano do 200 ng matrycy genomowego DNA. Sekwencje starterów eksonowych 45 były następujące: 45F2 5 (3-GGTGTCTTTCTGTCTTGTATCCTT-3 8; 45R2 5a-CCTATTAGATCTGTCGCCCTAC-3 .. Red Hot Taq (ABgene North America, Rochester, New York, USA) zastosowano przy 1,5 U na reakcję z 1,5 mM MgCl2. Genomowy DNA początkowo denaturowano w 94 ° C przez 3 minuty. Amplifikację przeprowadzono przez 35 cykli w następujących warunkach: 94 ° C przez 5 sekund, 50. 56 ° C (w zależności od pary primerów) przez 15 sekund i 72 ° C przez 30 sekund, z pojedynczym, końcowym wydłużeniem w 72 ° C. ° C trwające 3 minuty. Sekwencjonowanie produktu PCR przeprowadzono na sekwenatorze fluorescencyjnym ABI 373 po oczyszczeniu z zastosowaniem zestawu do oczyszczania QIAquick PCR (QIAGEN Inc., Valencia, California, USA). Analiza RT-transkryptów dystrofinowych. Całkowity RNA ekstrahowano przy użyciu zestawu RNeasy (QIAGEN Inc.), a cDNA zsyntetyzowano i zamplifikowano za pomocą zestawu One-Step RT-PCR (QIAGEN Inc.). Startery do przodu i do tyłu były następujące: CC42F-C48R (CC42F5a-ATGCTCCTGACCTCTGTGCTAAG-3C, C48R5a-ACC-ACAGCAGCAGATGATTTAACT-3 .) lub CC42F-CC45R (CC45R5a-GGCTTCCCAATTTTTCCTGTAGAA-3 .) lub CC45F-CC47R (CC45F 5a-CACCCTCAAAAACAGATGCCAGT-3a; C47R5a-TTCTGGGCTTATGGGAGCACTTAC-3 (3)). Odwrotną transkrypcję przeprowadzono w termocyklerze Hybaid przez 30 minut w 50 ° C, a następnie przez 15 minut w 95 ° C. Amplifikację przeprowadzono przez 30 cykli w następujących warunkach: 94 ° C przez minutę, 52 ° C przez 40 sekund i 72 ° C przez 50 sekund, z końcowym wydłużaniem w 72 ° C przez 10 minut. Drugą rundę amplifikacji PCR przeprowadzono przy użyciu 5 .l nierozcieńczonego (DMD-BMT1) lub rozcieńczonego (produkt PCR 1: 100, bez kontroli) z pierwszej rundy amplifikacji. Zastosowano dwieście nanogramów starterów dystrofiny (C43F-C48R, C43F-C47R, C43F-CC45R, CC45F-C46R) (C43F5C-CGCTCTGTGGAAAGGGTGAAGCTAC-3 (3 C46R5a-TTCAAGTGGGATACTAGCAATGT-3a) w identycznych warunkach amplifikacji. Produkty PCR zatężono pod próżnią szybkościową i naniesiono na 1,5% żelu agarozowym NuSieve. Prążki oczyszczono na żelu (QIAGEN Inc.) i zsekwencjonowano na sekwenatorze ABI 373. Do RT-PCR w czasie rzeczywistym (Taqman, Applied Biosystems Inc., Foster City, Kalifornia, USA) opracowano startery i sondy (ABI Software Inc., Foster City, Kalifornia, USA) w celu swoistej amplifikacji dystrofiny pełnej długości (startery 44F 5a -TCCCCAGTTGCATTCAATGTT-3a, 45R 5a-ATCTTAAGGAACTCCAGGATGGC-3a, sonda Taqman 5a-TGACAACAGTTTGCCGCTGCCC-3a); Izoforma 44-46 (z ramki, primery 44F 5a-TGACAAGATATTCTTTTG-TTCTTCTAGCCT-3a; 46R 5a-CAGTTTCTCAGAAAGACACAAATTCC-3a; Sonda Taqman 5a-AAGATACCATTTGTATTTAGCATGTTCCCAATTCTCA-3 a); 43-46 (w ramce, startery 43F 5a -TCATTTAAATCTCTTTTAAATTCTGACAA-3a; 46R 5a-CCAATGGGAAAAAGTTAACAAAATGTA-3 ., sonda Taqmana 5a-TCTTTTGTTCTTCTAGCCCTTGTCGGTCCTT-3.) I 44-48 (w ramce, startery 44F 5. CATGCTAAATACAAATGGTATCTTAAGGT-3a; 48R 5a-CAGAGCTGCCCAAGGTCTTTTAT-3 ., sonda Taąman a 5a -TCCAGAGCTTTACCTGAGAAACAAGGAGAAATTG-3.). Startery i sondy zastosowano w mieszaninie Master Mix Taqman Universal PCR przy końcowym stężeniu 200 .m. Warunki PCR wynosiły 2 minuty w 50 ° C (raz), 10 minut w 95 ° C (raz), a następnie 15 sekund w 95 ° C i minuta w 60 ° C przez 40 cykli (jednokrotna PCR). Immunohistochemia. MSC DMD-BMT1 hodowane na szklanych komorach śluzowych barwiono mysim anty-ludzkim CD105 (rozcieńczenie 1:20; BD PharMingen, San Diego, Kalifornia, USA). W tkance mięśniowej wycinano 10-metrowe skrawki z migdałowatych biopsji mięśni. Dystrofinę wykrywano przy użyciu następujących pierwszorzędowych Ab: MANDYS102 (epitop eksonowy 43), MANEX 46B (epitop eksonów 46) (24, 37), rozcieńczonego 1:20; NCL-DYS1 i NCL-DYS2 (Novocastra Laboratories, Newcastle, Wielka Brytania), rozcieńczone 1: 100. Oczyszczony przez powinowactwo królik poliklonalny Ab CAP 6-10 skierowany do reszt dystrofii cDNA 6,181. 9,544 (eksony egzonu 42. 64 białka) zastosowano w końcowym stężeniu 0,3. G / ml (rozcieńczonym 1: 1,000) (38). Hodowane komórki lub skrawki tkanek inkubowano z pierwszorzędowym Ab przez noc w 4 ° C, płukano trzy razy przez 10 minut w PBS w temperaturze pokojowej i inkubowano w temperaturze pokojowej przez godzinę za pomocą sprzężonego z FITC lub Cy5 sprzężonego Ab ( rozcieńczony 1: 100, Jackson Immunochemicals Inc., West Grove, Pennsylvania, USA). Skrawki ponownie przemyto w PBS, zamontowano w Vectashield (Vector Laboratories, Burlingame, California, USA) i zbadano przy użyciu mikroskopu Zeiss Axiophot (Carl Zeiss Inc., Thornwood, New York, USA) (32). Taki sam protokół zastosowano do równoczesnego wykrywania miofibrów dodatnich pod względem dystrofiny i limfocytów T przy użyciu anty-dystrofiny CAP 6-10 (rozcieńczony 1: 1000) i anty-ludzkiego CD2 (rozcieńczony 1: 100; DAKO Corp., Carpinteria, California, USA ) przez noc w temperaturze 4 ° C, a następnie inkubowano z anty-króliczym Cy5 i anty-mysim FITC (Jackson Immunochemicals Inc.), oba rozcieńczone 1: 100
[patrz też: przeszczep szpiku kostnego, podchloryn sodu dawkowanie, czym słodzić zamiast cukru ]
[patrz też: centrum pszczelarskie łysoń, sklep pszczelarski łysoń, bartnik bielsko ]