Dla każdej reakcji PCR, 300 ng starterów do przodu lub do tyłu dodano do 200 ng matrycy genomowego DNA. Sekwencje starterów eksonowych 45 były następujące: 45F2 5 (3-GGTGTCTTTCTGTCTTGTATCCTT-3 8; 45R2 5a-CCTATTAGATCTGTCGCCCTAC-3 .. Red Hot Taq (ABgene North America, Rochester, New York, USA) zastosowano przy 1,5 U na reakcję z 1,5 mM MgCl2. Genomowy DNA początkowo denaturowano w 94 ° C przez 3 minuty. Amplifikację przeprowadzono przez 35 cykli w następujących warunkach: 94 ° C przez 5 sekund, 50. 56 ° C (w zależności od pary primerów) przez 15 sekund i 72 ° C przez 30 sekund, z pojedynczym, końcowym wydłużeniem w 72 ° C. ° C trwające 3 minuty. Sekwencjonowanie produktu PCR przeprowadzono na sekwenatorze fluorescencyjnym ABI 373 po oczyszczeniu z zastosowaniem zestawu do oczyszczania QIAquick PCR (QIAGEN Inc., Valencia, California, USA). Analiza RT-transkryptów dystrofinowych. Całkowity RNA ekstrahowano przy użyciu zestawu RNeasy (QIAGEN Inc.), a cDNA zsyntetyzowano i zamplifikowano za pomocą zestawu One-Step RT-PCR (QIAGEN Inc.). Startery do przodu i do tyłu były następujące: CC42F-C48R (CC42F5a-ATGCTCCTGACCTCTGTGCTAAG-3C, C48R5a-ACC-ACAGCAGCAGATGATTTAACT-3 .) lub CC42F-CC45R (CC45R5a-GGCTTCCCAATTTTTCCTGTAGAA-3 .) lub CC45F-CC47R (CC45F 5a-CACCCTCAAAAACAGATGCCAGT-3a; C47R5a-TTCTGGGCTTATGGGAGCACTTAC-3 (3)). Odwrotną transkrypcję przeprowadzono w termocyklerze Hybaid przez 30 minut w 50 ° C, a następnie przez 15 minut w 95 ° C. Amplifikację przeprowadzono przez 30 cykli w następujących warunkach: 94 ° C przez minutę, 52 ° C przez 40 sekund i 72 ° C przez 50 sekund, z końcowym wydłużaniem w 72 ° C przez 10 minut. Drugą rundę amplifikacji PCR przeprowadzono przy użyciu 5 .l nierozcieńczonego (DMD-BMT1) lub rozcieńczonego (produkt PCR 1: 100, bez kontroli) z pierwszej rundy amplifikacji. Zastosowano dwieście nanogramów starterów dystrofiny (C43F-C48R, C43F-C47R, C43F-CC45R, CC45F-C46R) (C43F5C-CGCTCTGTGGAAAGGGTGAAGCTAC-3 (3 C46R5a-TTCAAGTGGGATACTAGCAATGT-3a) w identycznych warunkach amplifikacji. Produkty PCR zatężono pod próżnią szybkościową i naniesiono na 1,5% żelu agarozowym NuSieve. Prążki oczyszczono na żelu (QIAGEN Inc.) i zsekwencjonowano na sekwenatorze ABI 373. Do RT-PCR w czasie rzeczywistym (Taqman, Applied Biosystems Inc., Foster City, Kalifornia, USA) opracowano startery i sondy (ABI Software Inc., Foster City, Kalifornia, USA) w celu swoistej amplifikacji dystrofiny pełnej długości (startery 44F 5a -TCCCCAGTTGCATTCAATGTT-3a, 45R 5a-ATCTTAAGGAACTCCAGGATGGC-3a, sonda Taqman 5a-TGACAACAGTTTGCCGCTGCCC-3a); Izoforma 44-46 (z ramki, primery 44F 5a-TGACAAGATATTCTTTTG-TTCTTCTAGCCT-3a; 46R 5a-CAGTTTCTCAGAAAGACACAAATTCC-3a; Sonda Taqman 5a-AAGATACCATTTGTATTTAGCATGTTCCCAATTCTCA-3 a); 43-46 (w ramce, startery 43F 5a -TCATTTAAATCTCTTTTAAATTCTGACAA-3a; 46R 5a-CCAATGGGAAAAAGTTAACAAAATGTA-3 ., sonda Taqmana 5a-TCTTTTGTTCTTCTAGCCCTTGTCGGTCCTT-3.) I 44-48 (w ramce, startery 44F 5. CATGCTAAATACAAATGGTATCTTAAGGT-3a; 48R 5a-CAGAGCTGCCCAAGGTCTTTTAT-3 ., sonda Taąman a 5a -TCCAGAGCTTTACCTGAGAAACAAGGAGAAATTG-3.). Startery i sondy zastosowano w mieszaninie Master Mix Taqman Universal PCR przy końcowym stężeniu 200 .m. Warunki PCR wynosiły 2 minuty w 50 ° C (raz), 10 minut w 95 ° C (raz), a następnie 15 sekund w 95 ° C i minuta w 60 ° C przez 40 cykli (jednokrotna PCR). Immunohistochemia. MSC DMD-BMT1 hodowane na szklanych komorach śluzowych barwiono mysim anty-ludzkim CD105 (rozcieńczenie 1:20; BD PharMingen, San Diego, Kalifornia, USA). W tkance mięśniowej wycinano 10-metrowe skrawki z migdałowatych biopsji mięśni. Dystrofinę wykrywano przy użyciu następujących pierwszorzędowych Ab: MANDYS102 (epitop eksonowy 43), MANEX 46B (epitop eksonów 46) (24, 37), rozcieńczonego 1:20; NCL-DYS1 i NCL-DYS2 (Novocastra Laboratories, Newcastle, Wielka Brytania), rozcieńczone 1: 100. Oczyszczony przez powinowactwo królik poliklonalny Ab CAP 6-10 skierowany do reszt dystrofii cDNA 6,181. 9,544 (eksony egzonu 42. 64 białka) zastosowano w końcowym stężeniu 0,3. G / ml (rozcieńczonym 1: 1,000) (38). Hodowane komórki lub skrawki tkanek inkubowano z pierwszorzędowym Ab przez noc w 4 ° C, płukano trzy razy przez 10 minut w PBS w temperaturze pokojowej i inkubowano w temperaturze pokojowej przez godzinę za pomocą sprzężonego z FITC lub Cy5 sprzężonego Ab ( rozcieńczony 1: 100, Jackson Immunochemicals Inc., West Grove, Pennsylvania, USA). Skrawki ponownie przemyto w PBS, zamontowano w Vectashield (Vector Laboratories, Burlingame, California, USA) i zbadano przy użyciu mikroskopu Zeiss Axiophot (Carl Zeiss Inc., Thornwood, New York, USA) (32). Taki sam protokół zastosowano do równoczesnego wykrywania miofibrów dodatnich pod względem dystrofiny i limfocytów T przy użyciu anty-dystrofiny CAP 6-10 (rozcieńczony 1: 1000) i anty-ludzkiego CD2 (rozcieńczony 1: 100; DAKO Corp., Carpinteria, California, USA ) przez noc w temperaturze 4 ° C, a następnie inkubowano z anty-króliczym Cy5 i anty-mysim FITC (Jackson Immunochemicals Inc.), oba rozcieńczone 1: 100
[patrz też: przeszczep szpiku kostnego, podchloryn sodu dawkowanie, czym słodzić zamiast cukru ]
[patrz też: centrum pszczelarskie łysoń, sklep pszczelarski łysoń, bartnik bielsko ]