Długotrwałe utrzymywanie się jąder dawców u pacjentów z dystrofią mięśniową Duchennea otrzymujących przeszczep szpiku kostnego cd

Do cytometrii przepływowej zakupiono przeciwciało anty-CD5 (Leu-1) z Becton-Dickinson Immunocytometry Systems (San Jose, Kalifornia, USA). Fluorescencja hybrydyzacja in-situ. Po immunohistochemii, szkiełka nakrywkowe zostały usunięte, a sekcje tkanki mięśniowej zostały ponownie wstawione w Histochoice (AMRESCO Inc., Solon, Ohio, USA), jak opisano wcześniej (39). Klon genomowego faga. NN.1 lub klon kosmidu, CyD4.87 (40) zawierający sekwencje genomowe, flankujące i obejmujące ekson 45 dystrofiny, były osobno znakowane przez nicianową translację z digoksygeniną-11-dUTP (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, Indiana, USA) stosując .g oczyszczonego DNA (41). Sonda centromerowa znakowana chromosomem FITC została zakupiona (Rainbow Scientific Inc., Windsor, Connecticut, USA) i użyta zgodnie z instrukcjami producenta. Skrawki i sondę denaturowano w temperaturze 70 ° C i dodano 200 ng denaturowanej, wcześniej przedtem dootrzewionej sondy. NN.1 lub CyD4.87 znakowanej digoksygeniną na szkiełko. Skrawki hybrydyzowano przez noc w 37 ° C i poddano obróbce, jak opisano poprzednio (39). Wyniki Historia kliniczna. DMD-BMT1 jest 15-letnim mężczyzną, u którego zdiagnozowano SCID związany z X w 6 miesiącu. Była historia matczynych dzieci płci męskiej, które zmarły na infekcje oportunistyczne w dzieciństwie. DMD-BMT1 otrzymywał kondycjonowanie cyklofosfamidem i globuliną przeciw tymocytem przed otrzymaniem HF-haploidentycznego BMT zubożonego w limfocyty T od ojca. Zmniejszenie limfocytów T osiągnięto przez inkubację szpiku dawcy z mAb anty-CD5 i dopełniaczem. Ponieważ pacjent nie otrzymał warunkowania mieloablacyjnego, spodziewanym rezultatem po BMT jest to, że miałby limfocyty T pochodzące od dawcy, ale wszystkie inne linie krwiotwórcze byłyby wywodzące się z gospodarza. Po przeszczepie DMD-BMT1 miał ostrą chorobę przeszczepu przeciw gospodarzowi (GVHD) stopnia 3. wymagającą immunosupresji z cyklosporyną i steroidami. Układ odpornościowy DMD-BMT1. Wykazuje trwały brak funkcji humoralnej, objawiający się przewlekłym nawracającym zakażeniem ucha środkowego. Był on leczony immunoglobuliną dożylną co miesiąc z powodu hipogammaglobulinemii. DMD-BMT1 chodził w wieku 2 lat, opóźnienie przypisano jego trudnemu kursowi po BMT. Jego rodzice stwierdzili, że nie interesuje go aktywność fizyczna, ale jego rozwój intelektualny był powyżej średniej. Podczas zaplanowanej wizyty w wieku 12 lat odnotowano objawy zgodne z dystrofią mięśniową, w tym podwyższoną wartością kinazy kreatynowej w surowicy (8 000 – 9 000 IU / ml), historią upadku w szkole, skróceniem ścięgien Achillesa, przerostem mięśni kończyn i objawem Gowera. (22). Analiza DNA leukocytarnego krwi wykazała delecję eksonu 45 dystrofiny 45, chociaż słaby sygnał był obecny po długiej ekspozycji autoradiogramu. Obecnie, w wieku 15 lat, DMD-BMT1 może nadal chodzić, ale korzysta z wózka inwalidzkiego przez około 50% czasu. Diagnostyka molekularna DMD-BMT1. Aby potwierdzić delecję eksonu 45 dystrofiny 45 w DMD-BMT1, ustalono linię komórek fibroblastów skóry pacjenta. Amplifikacja PCR DNA pochodzącego od fibroblastów została przeprowadzona przy użyciu starterów do wszystkich 79 egzonów dystrofiny. Wszystkie egzony uległy amplifikacji z nieobjętej kontrolą, i tylko ekson 45 nie zdołał zamplifikować z DMD-BMT1, tym samym zgadzając się z pierwotnym odkryciem, że delecja jest ograniczona do egzonu 45 dystrofiny (Figura 1a). Figura 1Dokładanie eksonu dystrofiny 45 w genomowym DNA DMD-BMT1 przez PCR. (a) amplifikacja DNA przeprowadzona przy użyciu starterów do eksonów dystrofiny 42. 47. Próbki genomowego DNA pochodzą od nietkniętej osobniczo (+) lub fibroblastów skóry DMD-BMT1 (D). Ujemna kontrola wody (a) jest obecna dla każdego zestawu starterów. M, markery masy cząsteczkowej. (b) Koamplifizacja eksonów dystrofiny 40 (599 bp) i 45 (383 bp) z genomowego DNA osobnika nie dotkniętego chorobą (ścieżka 1), komórek T oczyszczonych DMD-BMT1 (linia 2) lub komórek mieloidalnych (linia 3). W, kontrola wody. (c) Chromatogramy analiz sekwencji DNA przeprowadzone na eksonie 45 pasm dystrofiny zamplifikowanej przez PCR z DMD-BMT1 i jego rodziców. DMD BMT-1 i jego ojciec są homozygotyczni pod względem A przy nukleotydzie 143 powyżej eksonu 45, podczas gdy matka ma G w tej pozycji. Aby określić udział komórek dawcy w krwi obwodowej DMD-BMT1 po BMT, genomowe DNA ekstrahowano z limfocytów T DMD-BMT1 i frakcji komórek szpikowych. Amplifikacja przez PCR przy użyciu starterów do eksonów dystrofiny 40 i 45 ujawniła, że limfocyty T zawierały komórki pochodzenia od dawcy, jak oczekiwano, podczas gdy tylko bardzo słabe pasmo eksonu 45 było widoczne w komórkach mieloidalnych, wskazując na ich przeważające pochodzenie gospodarza (Figura 1b). Amplifikacja eksonu 40 pozostała niezmieniona we wszystkich frakcjach. Aby wykluczyć możliwość, że DMD-BMT1 jest mozaiką somatyczną dla delecji genu dystrofiny, co ograniczyłoby zdolność do jednoznacznego wykrywania komórek pochodzących od dawcy, status jego matki był ustalony przez dwie niezależne metody
[więcej w: operacje plastyczne dr szczyt, jak zakończyć karmienie piersią, podchloryn sodu dawkowanie ]
[przypisy: przychodnia bielsko komorowicka, ostry dyzur okulistyczny, klinika stomatologiczna łódź ]