Długotrwałe utrzymywanie się jąder dawców u pacjentów z dystrofią mięśniową Duchennea otrzymujących przeszczep szpiku kostnego czesc 4

Amplifikacja PCR i analiza sekwencji eksonu 45 dystrofiny na genomowym DNA pochodzącym z krwi obwodowej DMD-BMT1 (limfocyty T i komórki mieloidalne) oraz jego rodzice ujawnili polimorfizm 143 zasad w eksonie 45 flankującym intron. Matka była najwyraźniej homozygotyczna pod względem G, podczas gdy ojciec i DMD-BMT1 mieli A w tej pozycji (rysunek 1c). Ponieważ DMD jest zaburzeniem sprzężonym z chromosomem X, brak G w komórkach szpikowych z DMD-BMT1 jest zgodny z dziedziczeniem zerowego allelu DMD od matki. Jej status nośnika DMD został następnie potwierdzony przez analizę fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) przy użyciu sondy genomowego DNA zawierającej ekson 45 dystrofiny (. NN.1). Chromosom rozprzestrzeniający się z niezakażonej samicy wykazał obecność sygnałów hybrydyzacji na krótkim ramieniu obu chromosomów X (ryc. 2a), podczas gdy chromosom rozprzestrzeniający się z matki DMD-BMT1 s konsekwentnie pokazywał sygnały tylko na jednym chromosomie X (ryc. 2b), potwierdzając jej status nosiciela i zasadniczo wyklucza możliwość, że DMD-BMT1 jest mozaiką somatyczną dla delecji ekson 45 dystrofiny. Jądry międzyfazowe z fibroblastów hodowanych w DMD-BMT1 (3 nie wykazywały hybrydyzacji z sondą eksonu 45 dystrofiny, podczas gdy sonda centromerowa chromosomu X konsekwentnie wykazywała jeden sygnał hybrydyzacji (Figura 2c). Figura 2Detekcja delecji egzonu 45 dystrofiny w DMD-BMT1 i jego matce za pomocą analizy FISH. (a) Nie dotknięta kobieta. Chromosomy są barwione kontrastowo na niebiesko za pomocą dichlorowodorku 4., 6-diamidyno-2-fenyloindolu (DAPI) i oba chromosomy X mają czerwone sygnały hybrydyzacji z użyciem sondy swoistej dla ekson 45 dystrofiny. (b) Rozprzestrzenianie chromosomów matki DMD-BMT1. Tylko jeden chromosom X hybrydyzował z sondą specyficzną dla eksonów dystrofiny 45, potwierdzając w ten sposób jej status nośnika DMD w delecji eksonu 45 dystrofiny. (c) Jądra fibroblastów DMD-BMT1 hybrydyzowały z sondą X-centromerową (zielony) i sondą eksonową dystoniny 45 (czerwony), która nie uległa hybrydyzacji. (d i e) Wykrywanie jąder pochodzących od dawcy w hodowlach MSC DMD-BMT1. (d) W wyniku immunofluorescencji ponad 95% hodowanych MSC z DMD-BMT1 jest dodatnich pod względem CD105 (zielony). (e) Analiza FISH z użyciem sondy kosmidowej dystoniny ekson 45 (czerwonej) pokazuje obecność MSC pochodzących od dawcy. (f i g) Jednoczesna hybrydyzacja jąder DMD-BMT1 MSC z sondą X-centromerową DNA (zielony) i eksonem dystoniny 45 (czerwony) przez FISH. Jądra dawcy w MSC DMD-BMT1 są diploidalne. (h i i) Jądra od niezakażonej samicy hybrydyzowanej przez FISH z sondami FISH z X-centromerowym i dystrofinowym eksonem 45. W każdym jądrze oczekuje się dwóch zielonych i czerwonych sygnałów hybrydyzacji. Jądra są barwione kontrastowo na niebiesko przez DAPI. Aby ocenić, czy MSC pochodzenia dawcy nadal były obecne w DMD-BMT1 13 lat po transplantacji, przeprowadzono aspirację szpiku i komórki adherentne hodowano in vitro. Hodowla MSC była większa niż 99% pozytywna dla CD105, markera MSC (10,42) (Figura 2d). Jednoczesne analizy FISH i immunofluorescencji wykazały obecność jąder donorowych w CD105 + MSC przy częstości 9 w 1165 jądrach (0,77%) (Figura 2e). Ostatnie doniesienia wskazują, że komórki BM myszy mogą spontanicznie łączyć się z innymi komórkami jednojądrzastymi, a następnie przekształcać się w duże komórki tetraploidalne po fuzji jądrowej (20). Aby ustalić, czy komórki dawcy w hodowlach MSC DMD-BMT1 były diploidalne, a nie poddane fuzji z komórkami gospodarza, zbadaliśmy jądra międzyfazowe za pomocą FISH, stosując jednocześnie sondę centromerową chromosomu X (zielony) i sondę DNA ekson 45 dystrofiny (czerwony). Jądra dawca wydawały się mieć pojedyncze czerwone i zielone sygnały hybrydyzacji (Figura 2, fxg), podczas gdy jądra z niezakażonej samicy wykazywały obecność podwójnych zielonych i czerwonych sygnałów hybrydyzacji w ponad 90% jąder, zgodnie z oczekiwaniami (Figura 2). , cześć). Wyniki te wskazują, że jądra MSC pochodzące od dawców obecne w szpiku DMD-BMT1 przez dziesięć lat po diploidalnym BMT nie są połączone z jądrami gospodarza. Analizy biopsji mięśni. W celu potwierdzenia wszczepienia komórek dawcy i ekspresji prawidłowej dystrofiny w mięśniu szkieletowym DMD-BMT1, pobierano chirurgicznie z lewego łydki i prawego mięśnia czworogłowego. Biopsje mięśniowe od osobnika nie dotkniętego chorobą, jak również dwóch niepowiązanych pacjentów z DMD (D1 i D2), przeprowadzono dla wskazań klinicznych niezależnych od tego badania i dostarczono je z innych instytucji jako tkanek kontrolnych. Pacjenci DMD D1 i D2 mieli potwierdzoną pojedynczą egzonową delecję eksonu 45 dystrofiny 45, ale nie otrzymywali BMT (dane nie przedstawione). Immunofluorescencja i analizy FISH. W celu analizy immunofluorescencyjnej, zamrożone wycinki mięśni z DMD-BMT1 i od kontrolnych pacjentów z DMD D1 i D2 podzielono seryjnie i indywidualnie inkubowano z przeciwciałami Ab rozpoznającymi różne epitopy dystrofiny.
[więcej w: operacje plastyczne dr szczyt, objawy refluksu u dzieci, łysoń sklep ]
[przypisy: carcinoma adenoides cysticum, operacje plastyczne dr szczyt, finasteryd skutki uboczne ]