Enteroagregacyjna Escherichia coli wyraża nową flagelinę, która powoduje uwalnianie IL-8 z komórek nabłonka jelitowego ad 5

Ta strategia wytworzyła częściowy merodiploid, 042: fliC, niosący wektor samobójczy. Tożsamość 042: fliC. jako pochodną 042 potwierdzono przez wzorzec wrażliwości na antybiotyki (oporny na chloramfenikol i tetracyklinę), przez agregacyjne przyleganie do komórek HEp-2, przez tworzenie biofilmu, przez obecność plazmidu o takich samych rozmiarach i wzorach restrykcyjnych jak plazmid 042 AA i poprzez aglutynację z antyserum O44 (Denka Seiken Co., Tokio, Japonia). Hybrydyzacja południowa potwierdziła miejsce wstawienia plazmidu samobójczego (Figura 4b). Ponadto, uwalnianie plazmidu uwolniło nowy plazmid o wielkości około 15 kb, z kasetą opornościową na R6K i kanamycynę. Sekwencjonowanie fragmentów tego plazmidu flankującego połączenie pJP5603 / fliC ujawniło przewidywaną duplikowaną kopię regionu 588-bp genu fliC, potwierdzając częściowy merodiploid (nie pokazany). Rysunek 4Budowa 042: fliC .. (a) Mapy restrykcyjne pJP5603 (3,1 kb) ze sklonowanym fragmentem PCR o wielkości 588 bp z fliCEAEC (szary pasek), fliCEAEC typu dzikiego (linia przerywana) i mapa pożądanego transkoniuganta. Wyświetlane są miejsca restrykcyjne i lokalizacje (Bam, BamHI, Ssp, SspI, Stu, StuI, Spe, SpeI, Xba, XbaI, Eco, EcoRI). (b) Southern hybrydyzacji 042 i 042: fliC. stosując fragment PCR o wielkości 588 bp z genomu 042 jako sondę. Ścieżka 1: Sonda, ng. Ścieżka 2: 042, cięcie SpeI / StuI. Ścieżka 3: 042, cięcie SpeI / SspI. Ścieżka 4: 042: cięcie fliC ., SpeI / StuI. Ścieżka 5: 042: cięcie fliC ., SpeI / SspI. Kmr, kaseta oporności na kanamycynę; TTA, stop kodonu; ori R6K, miejsce rozpoczęcia replikacji. Działania zwolnienia IL-8. 042 i 042: fliC. porównywano stosując zarówno żywe bakterie, jak i supernatanty z hodowli. Jak pokazano na rys. 5c, ani live 042: fliC. (n = 3) i supernatanty z hodowli (n = 5) powodowały wykrywalne uwalnianie IL-8 z komórek Caco-2 przy podobnej gęstości bakteryjnej do tej z hodowli aktywnych 042 (co określono przez rozcieńczenie liczby kolonii kultur bakteryjnych). Figura 5: Mobilność i aktywność uwalniająca IL-8a 042 i 042: fliC. (a) Wzrost po 72 godzinach na płytach roju bez kanamycyny. Bakterie zebrane z obrzeża (obszaru roju) lewej dolnej płytki straciły oporność na kanamycynę. (b) Mikroskopia elektronowa z ujemnym wybarwianiem dla wici. Bar = 1. M. (c) uwalnianie IL-8 z komórek Caco-2 inkubowanych przez 3 godziny z supernatantami hodowli EAEC 042 hodowanymi w 1% tryptonie (n = 5), 1% tryptonem z 3% NaCl (n = 2), supernatantami hodowli (sup ) (n = 5) lub żywe kultury (n = 3) 042: fliC. hoduje się w 1% tryptonie. P <0,05 według testu Kruskala-Wallisa. 042: fliC. wykazały zmniejszoną ruchliwość w porównaniu z dzikim typem 042 podczas wzrostu na płytach roju (Figura 5a). Inne cechy fenotypowe 042 (wzrost, przyleganie, tworzenie biofilmu) nie uległy zmianie w 042: fliC. Odwrócenie się do stanu ruchliwego mogło nastąpić spontanicznie w nieobecności selekcji kanamycyny, przypuszczalnie w wyniku zdarzenia rekombinacji ułatwionego przez powtarzaną część genu fliC. Odwrócenie się do ruchliwości typu dzikiego również przywróciło aktywność uwalniającą IL-8 (nie pokazaną). Kilka szczepów zbadano pod kątem wici za pomocą mikroskopii elektronowej. Jak pokazano na rysunku 5b, 042 jest wysoce wici, podczas gdy 042: fliC. nie ma widocznej wici (na wielu polach). Ponadto 042 hodowane w LB z 3% NaCl znacznie zmniejszyło ekspresję wici i nie uwolniło IL-8 z komórek Caco-2; dodanie 3% NaCl po nocnym wzroście nie miało wpływu na uwalnianie IL-8. Flagelina EAEC wyrażona w BL21 powoduje uwalnianie IL-8. Jak opisano w Methods, gen fliC został sklonowany do wektora ekspresyjnego z końcowym znacznikiem 6-His NH2. Maksymalna ekspresja wystąpiła 2 godziny po dodaniu IPTG do hodowli w połowie fazy logarytmicznej, chociaż pewna ekspresja była obecna w niestymulowanych hodowlach, odzwierciedlając podstawową transkrypcję na promotorze T7. Jak pokazano na Fig. 6, FliC-EAEC, ale nie wyrażone białko kontrolne, immunoreaktywowano z przeciwciałem przeciw flagelarnym, podczas gdy oba białka reagowały z Ni2 + -HRP. Surowe lizaty BL21-pLysS: pfliC, ale nie BL21-pLysS: pCRT7 / NT-E3, powodowały uwalnianie IL-8 z komórek Caco-2. Aktywność swoistą lizatów IL-8P zwiększono przez oczyszczenie na kolumnie Ni2 + (nie pokazano). Figura 6 Ekspresja i oczyszczanie FliC-EAEC. (a) BL21 (DE3) pLysS stransformowany pfliC lub pCRT7 / NT-E3 (kontrola ekspresji) zebrano z hodowli w połowie fazy log we wskazanym czasie po dodaniu IPTG. Dziesięć mikrolitrów lizatu bakteryjnego załadowano na studzienkę dla 9% SDS-PAGE i przeniesiono na błonę PVDF po uruchomieniu żelu. Membranę sondowano Ni2 + -HRP w celu wykrycia białek zawierających polihistydynę, odpędzono 0,2 N NaOH i powtórnie badano poliklonalną przeciwserwieniową surowicą odpornościową [więcej w: carcinoma adenoides cysticum, depilacja brazylijska poznań, sprzęt pszczelarski łysoń ] [patrz też: carcinoma adenoides cysticum, operacje plastyczne dr szczyt, finasteryd skutki uboczne ]