Enteroagregacyjna Escherichia coli wyraża nową flagelinę, która powoduje uwalnianie IL-8 z komórek nabłonka jelitowego ad 6

Ścieżka zawierająca 2,5 gramy wici EAEC 042 (A) została włączona do żelu jako kontrola. W celu uwolnienia IL-8 oczyszczoną wici (72 ng) lub lizat bakteryjny (1 ug) dodano do 500 ul do studzienek komórek Caco-2 w tym samym eksperymencie, a supernatant oznaczono po 3 godzinach inkubacji. (b) BL21 (DE3) pLysS: pfliC zebrano 2 godziny po dodaniu IPTG do hodowli w połowie fazy log. Lizaty oczyszczono przez chromatografię powinowactwa na niklu, wizualizowano na żelach 9% SDS-PAGE i przeniesiono na membranę PVDF, którą sondowano Ni2 + -HRP. Ścieżka 1: wici EAEC 042, 1,4 g. Ścieżka 2: Surowy lizat, 15 ug. Ścieżka 3: Przepływ z kolumny niklu, 12,5 g. Ścieżka 4: Eluat z kolumny, 10,8 g. W celu uwolnienia IL-8 testowano 350 nig wirusa, .g lizatu bakteryjnego i .g eluowanej flageliny. Surowica H18 hamuje uwalnianie IL-8 przez flagelinę 042. Jak wspomniano wcześniej, EAEC 042 ma serotyp O44: H18. Zastosowano komercyjnie dostępną surowicę odpornościową na wić H18 (Denka Seiken Co.), aby spróbować zaadsorbować FliC-EAEC i zahamować uwalnianie IL-8 z komórek Caco-2. Ta antyserum immunoreaktykuje metodą Western blot z flageliną oczyszczoną z 042 lub FliC-EAEC wyrażoną w BL21 (nie pokazano). Dodanie 1. 10 ul surowicy H18 do komórek Caco-2 zahamowało uwalnianie IL-8 z komórek Caco-2 stymulowanych 042 supernatantami hodowli, oczyszczoną wici lub znakowaną His FliC-EAEC do 51,2. 11,2% poziomów kontrolnych (średnia . SD, n = 4, P = 0,025). Nie obserwowano hamowania uwalniania IL-8 w przypadku surowicy H7 lub poliklonalnej surowicy odpornościowej przeciwko Salmonella az. Sekwencjonowanie fliCEAEC i porównanie z innymi wici bakteryjnej. Sekwencję nukleotydową fliCEAEC uzyskano z pfliC (przedłożonego do GenBank, AF AF 194946). Przewidywana sekwencja aminokwasowa tego genu jest pokazana w porównaniu z flagelinami z S. dysenteriae, S. flexneri i E. coli K12 na Figurze 7. Cztery białka są prawie identyczne w ciągu pierwszych 150 i ostatnich 90 aminokwasów. FliC-EAEC i FliC-SD są całkowicie identyczne w ciągu pierwszych 200 reszt, a ponad 98% identyczne w ciągu ostatnich 420, ale tylko w 42% identyczne z aminokwasów od 220 do 270. Wyszukiwanie w bazie danych w tym regionie FliC-EAEC przy użyciu program FASTA z Genetics Computer Group (Madison, Wisconsin, USA) nie wykazał znaczącej homologii z żadnym znanym białkiem. Figura 7 Porównanie wyprowadzonych sekwencji aminokwasowych flagelin z EAEC 042 (EAEC), S. dysenteriae (SD), S. flexneri (SF) i E. coli K12 (K12). Opisano peptydy trypsyny zidentyfikowane za pomocą spektrometrii masowej z początkowego produktu oczyszczania supernatantów EAEC 042. Aminokwasy w flagelinie EAEC różniące się od flag S. dysenteriae przedstawiono powyżej linii. Strzałki reprezentują lokalizacje starterów do przodu i do tyłu stosowanych do generowania sondy fliC 588 bp. AF FlaC-EAEC 194946. Dyskusja Wykazaliśmy, że aktywność uwalniająca IL-8. EAEC 042 może być przypisana pojedynczej części białka, która ma sekwencję bardzo podobną do sekwencji flageliny z S. dysenteriae. Ponadto, wykazaliśmy, że wici od 042 i kilku innych izolatów EAEC są niezwykle silnie uwalniające IL-8, i że błądzący 042 traci aktywność uwalniającą IL-8P. Wreszcie flagelina EAEC wyrażona jako białko fuzyjne oznaczone His posiada taką samą aktywność. Odkrycia te pokazują, że czynnik uwalniający ILEC 8a jest w rzeczywistości białkiem wiciowym, który oddziałuje z komórkami nabłonkowymi, prowadząc do sekrecji IL-8. Co ciekawe, podczas gdy wici są zaangażowane w wytwarzanie stanu zapalnego przez kilka innych patogenów Gram-ujemnych, aktywność ta nie była wcześniej przypisywana pojedynczemu produktowi genowemu. Mutanty aflagellarowe Pseudomonas aeruginosa wykazują zmniejszoną chorobotwórczość w mysim modelu zapalenia płuc, a oczyszczone wici mogą same wywoływać zapalenie płuc (12). Ponadto, izolaty P. aeruginosa ze zmienioną ekspresją wićkowej wykazują zmniejszoną zdolność do uwalniania IL-8 z komórek nabłonka płucnego A549 (13). Izolaty Helicobacter pylori z naturalnymi polimorfizmami w genach flagelarnych indukują różne ilości uwalniania IL-8 z komórek nabłonka żołądka MKN45, a uwalnianie IL-8 koreluje z ruchliwością (14). Oczyszczona faza I Salmonella flagelina i Salmonella fliC ulegające ekspresji w E. coli powodują uwalnianie TNF-a. z ludzkiej linii komórkowej promonocytów (15). W końcu, wici Salmonella typhi upośledzają wychwyt antygenu i jego prezentację przez ludzkie makrofagi (16) i indukują kaskadę cytokin w tych komórkach (17). Podczas gdy większość ekspresyjnych wici E. coli jest ruchliwych, blisko spokrewnione gatunki Shigella były do niedawna uważane za pozbawione wić i zasadniczo nieruchome.
[patrz też: depilacja brazylijska poznań, klinika stomatologiczna łódź, dom latających sztyletów cda ]
[patrz też: dom latających sztyletów cda, depilacja brazylijska poznań, czym słodzić zamiast cukru ]