Enteroagregacyjna Escherichia coli wyraża nową flagelinę, która powoduje uwalnianie IL-8 z komórek nabłonka jelitowego ad

Gdy użyto żywych bakterii, komórki Caco-2 przepłukano dokładnie, a pożywkę zastąpiono identycznymi mediami bez penicyliny i streptomycyny przed dodaniem bakterii. Po 3 godzinach usunięto supernatanty. Monowarstwy komórek utrwalono metanolem przez 5 minut, a następnie wybarwiono barwnikiem Giemsa przez 20 minut w celu uwidocznienia bakterii i biofilmu. Preparaty bakteryjne. Izolaty bakteryjne stosowane w tym badaniu opisano w Tabeli 1. Dla testów uwalniania Caco-2 IL-8 bakterie hodowano przez 16-24 godzin w 1% tryptonie w 37 ° C z wytrząsaniem przy 200. 300 rpm. Do komórek Caco-2 dodano 20 .l żywej kultury bakteryjnej lub 50 .l supernatantu z hodowli po przesączeniu 0,2 .m i inkubowano przez 3 godziny. Tabela Izolaty bakteryjne stosowane w tym badaniu Aby wyizolować wici, bakterie osadzono przez odwirowanie, zawieszono ponownie w 30 ml 500 mM Tris (pH 8,0), a następnie mieszano z dużą prędkością przez 60 sekund w mieszalniku Sorvall Omni (Sorvall Products, Newtown, USA). Connecticut, USA). Bakterie i szczątki osadzano przez odwirowanie przy 8000 g przez 15 minut, a supernatant sklarowano przez filtrację (wielkość porów 0,8 urn). Flagella osadzano przez odwirowanie przy 100 000 g przez 60-90 minut, a następnie ponownie zawieszano w 5 ml PBS. W przypadku mniejszych objętości hodowli flagellinę wyizolowano przez denaturację kwasową. Peletki bakterii zawieszono w małej objętości 150 mM NaCl i 10 mM HC1 i obracano przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Supernatant zawierający depolimeryzowane wici oczyszczono przez odwirowanie przy 100000 g przez 60-90 minut i doprowadzono równowagę do pH 8,0 przez dodanie 50 mM Tris i 10 mM NaOH. Pozorna masa cząsteczkowa flageliny na SDS-PAGE była taka sama niezależnie od zastosowanej metody. Techniki oczyszczania białek. Białko uwalniające IL-8 (3 oczyszczono z supernatantów hodowli EAEC 042, prototypowego szczepu EAEC, który był biegunkowy w ochotnikach (10). Wszystkie etapy oczyszczania przeprowadzono w 4 ° C. Membrany i koncentratory do ultrafiltracji (membrana Amicon YM-10, Centricon-30 i Centriplus-30) otrzymano z Millipore Corp. (Bedford, Massachusetts, USA). Chromatografię przeprowadzono przy użyciu systemów Gradi-Frac i FPLC z Pharmacia Biotech AB (Uppsala, Szwecja). Zastosowano następujące podpory chromatograficzne i kolumny: DEAE-celuloza (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA); Sephacryl S-300 16/60, Mono-Q HR 5/5, szybki przepływ Butyl-Sepharose (Pharmacia Biotech AB); i hydroksyapatyt HTP Bio-Gel (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, California, USA). Stężenie białka zmierzono metodą Bradforda (przy użyciu odczynnika do oznaczania białka od Bio-Rad Laboratories Inc.). Białka wizualizowano za pomocą elektroforezy za pomocą 9% żeli poliakryloamidowych-SDS metodą Laemmli i barwienia błękitem Coomassie, Gelcode Blue (Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois, USA) lub amonowym azotanem srebra. Sekwencjonowanie białka. Po sekwencyjnej wymianie jonowej, przepuszczalności żelu, oddziaływaniu hydrofobowym i chromatografii kolumnowej na hydroksyapatycie, substancję uwalniającą IL-8. zatężono przez wytrącanie acetonem i przepuszczono przez żel 9% poliakrylamidowo-SDS. Pojedynczy widoczny prążek około 65 kDa został strawiony in situ trypsyną i zsekwencjonowany za pomocą tandemowej spektrometrii masowej w Biomedycznej Spektrometrii Masowej WM Keck University of Virginia. Homologię do opublikowanych sekwencji peptydowych określono przy użyciu programu BLAST z National Center for Biotechnology Information. Produkcja mutanta aflagellar. Następujące startery opracowano ze środkowej jednej trzeciej sekwencji fliCSD (z nukleotydów kodujących peptydy odpowiadające dwóm z tych otrzymanych z flageliny EAEC podczas spektrometrii mas) z miejscami Xbal i EcoRI, odpowiednio przy 5. końce: 5. -TCTAGATAAAACTCGATAATACGGGGG-3. i 5a-GAATTCTAACGGCGTTACGAAACGTTGT-3 .. Produkt 588 bp powielony tymi primerami z 042 genomowego DNA (przy użyciu polimerazy Taq z QIAGEN Inc., Valencia, Kalifornia, USA) zligowano z plazmidem samobójczym R6K pJP5603, który replikuje się tylko wtedy, gdy produkt genu pir jest dostarczany w trans (11) i elektroporowany do DH5a (. Pir). Transformanty selekcjonowano przez hodowlę na bulionie Luria (LB) z kanamycyną (30 .g / ml), a prawidłowy plazmid zidentyfikowano według wzoru restrykcyjnego. Ten plazmid następnie poddano elektroporacji do szczepu koniugacyjnego S17-1 (a pir) i skoniugowano do 042 przez krzyżowanie na filtrach. Transkoniuganty, które według przewidywań powstały w wyniku chromosomalnej insercji wektora przez rekombinację homologiczną, wybrano przez wzrost na LB z kanamycyną (30 .g / ml) i tetracykliną (24 .g / ml), a następnie badano przesiewowo pod kątem aktywności uwalniającej IL-8..
[przypisy: centrum pszczelarskie łysoń, wrzodziejące zapalenie jelita grubego dieta, jak zakończyć karmienie piersią ]
[hasła pokrewne: sklep łysoń, bartnik pl, sprzęt pszczelarski łysoń ]