Enteroagregacyjna Escherichia coli wyraża nową flagelinę, która powoduje uwalnianie IL-8 z komórek nabłonka jelitowego cd

Southern blotting przeprowadzono na membranach Zeta-Probe GT (Bio-Rad Laboratories Inc.) zgodnie z protokołem producenta. Ruchliwość oceniano przez wzrost na płytkach roju (1,55 g / l LB i 0,3% agar). Przyleganie HEp-2 określono tak jak w ref. 2. Ratowanie plazmidu z transkoniugantów przeprowadzono w następujący sposób: genomowy DNA pocięto BamHI i poddano ligacji w rozcieńczonym roztworze, aby ułatwić ligację homotopową. Produkt ligacji poddano elektroporacji do DH5a ((pir) i wysiano na agar kanamycynowy. Kolonie badano przesiewowo przez hybrydyzację z sondą 588-bp opisaną powyżej, a otrzymany plazmid (a15 kb) sekwencjonowano, stosując startery puck19 do przodu i do tyłu. Mikroskopia elektronowa. Bakterie z nasyconej nocnej hodowli granulowano przez delikatne odwirowanie, a następnie ponownie zawieszano w filtrowanej wodzie destylowanej. Podwielokrotności (10. L) zawiesiny naniesiono na siatki formvar powlekane węglem przez około 3. 4 minuty. Po szybkiej bibule nadmiaru zawiesiny, przez 5 . 15 sekund naniesiono 10. L molibdenianu amonu. Plamę następnie odfiltrowano, a kratki pozostawiono do wyschnięcia na powietrzu. Bakterie obserwowano i fotografowano w mikroskopie elektronowym JEOL 100CX (JEOL USA Inc., Peabody, Massachusetts, USA) przy 80 kV. Klonowanie i ekspresja flageliny EAEC. Następujące startery opracowano na podstawie opublikowanych sekwencji końcowych NH2 i COOH flageliny S. dysenteriae: 5 (3-GGATTCATGGCACAAGTCATTAAT-3. i 5a-TTCGAATTAACCCTGCTGCAGAGA-3 .. Użyto ich do amplifikacji fragmentu o około 1,8 kb z genomowego DNA wyizolowanego z EAEC 042. Ten fragment sklonowano w ramce z 5. znacznik 6-histydynowy (sześcio-His) w wektorze pCRT7 / NT-TOPO (Invitrogen Corp., Carlsbad, California, USA) i utrzymywany w Top10F. hosta, zgodnie z protokołem producenta. Plazmid zawierający gen fliC w ramce pfliC zweryfikowano przez sekwencjonowanie, a białko fuzyjne wyrażono w BL21 (DE3) pLysS zgodnie z protokołem producenta. Plazmid kontrolny dostarczony przez producenta (pCRT7 / NT-E3), wyrażający ludzką kinazę 58 kDa, wyrażono równolegle jako kontrolę. Komórki zebrano przez odwirowanie dwie godziny po indukcji hodowli w połowie fazy logarytmicznej za pomocą mM izopropylo-D-D-tiogalaktopiranozydu (IPTG). Lizę przeprowadzono w zalecanym przez producenta buforze do lizy przez powtarzane zamrażanie i rozmrażanie i sonikację. Wyznakowane His białka naniesiono na naładowane NiCl2 ml kolumny z chelatem metalu (Pharmacia Biotech AB) w buforze zawierającym 500 mM NaCl, 20 mM Tris (pH 8,0) i 5 mM imidazol. Następnie przemyto 20 mM imidazolem i eluowano w podobnym buforze za pomocą 100 mM imidazolu. Białko fuzyjne flageliny zidentyfikowano przez ELISA przy użyciu peroksydazy chrzanowej sprzężonej z Ni2 + zgodnie z protokołem producenta (Indie HisProbe-HRP, Pierce Chemical Co.) i metodą Western blot (patrz poniżej). Western blotting. Białka przepuszczano przez 9% żele SDS-PAGE i elektrotransferowano do membran PVDF (Millipore Corp.) przy 30 V przez noc. Zostały one zablokowane przy użyciu 5% beztłuszczowego mleka w proszku w TTBS (20 mM Tris przy pH 7,5, 150 mM NaCl i 0,05% Tween-20), a następnie hybrydyzowane przez 2 godziny z surowicą odpornościową Salmonella H z poli (Difco Laboratories, Detroit, Michigan , USA) w rozcieńczeniu 1: 1000 w TTBS z 1% żelatyny. Następnie godzinę sprzężono z peroksydazą sprzężoną z osłem anty-króliczą IgG (Amersham Life Science, Buckinghamshire, Wielka Brytania) i opracowano odczynniki do wykrywania światła ECL (Amersham Life Science). Wyznakowane przez His białka zidentyfikowano przez hybrydyzację z Indiami HisProbe-HRP zgodnie z protokołem producenta. Wyniki EAEC 042 indukuje uwalnianie IL-8 z jelitowych linii komórkowych. Wcześniej informowaliśmy, że prototyp izolatu EAEC, 042, powoduje, że komórki Caco-2 uwalniają IL-8 po zaledwie 3 godzinach ekspozycji na żywe bakterie lub wolne od komórek przesącze do hodowli. Wykazaliśmy również stabilność cieplną i wrażliwość proteazy tej aktywności uwalniającej IL-8 (3, oraz jej brak hamowania przez polimyksynę B (8). Ponieważ prozapalne cytokiny są regulowane w różny sposób w różnych unieśmiertelnionych liniach komórkowych, testowaliśmy komórki ludzkiego raka okrężnicy T84 i ludzkie fibroblasty okrężnicy CCD-18Co. Jak pokazano na Figurze 1, EAEC 042, prototyp szczepu, który jest patogenny u ochotników, spowodował znacznie więcej uwalniania IL-8 niż niepatogenne E. coli lub bulion hodowlany sam we wszystkich trzech typach komórek. Co interesujące, komórki T84 i CCD-18Co wykazują ekspresję mierzalnej IL-8 na początku, podczas gdy komórki Caco-2 nie. Z tego powodu użyliśmy komórek Caco-2 jako głównych komórek testowych dla białka uwalniającego IL-8. Figura 1IL-8 uwalnianie z jelitowych linii komórkowych w odpowiedzi na EAEC
[podobne: wrzodziejące zapalenie jelita grubego dieta, łysoń sklep, bartnik pl ]
[przypisy: centrum pszczelarskie łysoń, sklep pszczelarski łysoń, bartnik bielsko ]