Enteroagregacyjna Escherichia coli wyraża nową flagelinę, która powoduje uwalnianie IL-8 z komórek nabłonka jelitowego czesc 4

Pięciodniowe monowarstwy Caco-2 (czarne słupki), T84 (szare słupki) lub CCD-18Co (białe słupki) były eksponowane przez 3 godziny, aby żyć EAEC 042, przesącze nasyconych nocnych kultur EAEC 042, niepatogenne (kontrola) E. coli (HB101, K12 lub GDI 20) lub sam bulion hodowlany. Oddzielne osie Y odzwierciedlają dziesięciokrotnie większą ilość uwalniania IL-8 przez fibroblasty CCD-18Co w porównaniu z komórkami raka okrężnicy Caco-2 lub T84. Paski błędów przedstawiają SEM. Oczyszczanie i identyfikacja białka uwalniającego IL-8P z EAEC 042. Oczyściliśmy białko uwalniające IL-8P z supernatantów hodowli EAEC 042. Wygląd kolejnych produktów oczyszczania na żelach 9% SDS-PAGE pokazano na Figurze 2. Figura 2Gel (9% SDS-PAGE) sekwencyjnie oczyszczonych frakcji białkowych uwalniających IL-8P z supernatantów hodowli EAEC 042. Próbki zatężono przez ultrafiltrację membranową do objętości 25. L i prowadzono jednocześnie, z wyjątkiem ścieżki 7, którą przeprowadzono w oddzielnym żelu. Ścieżka 1: Supernatant z hodowli z nocnego wzrostu 042. Ścieżka 2: adsorpcja DEAE-celuloza i elucja NaCl. Ścieżka 3: Sześćdziesiąt procent precypitacji siarczanem amonu. Ścieżka 4: Chromatografia żelowa w obecności 6 M guanidynowego-HCl. Ścieżka 5: Połączone, aktywne frakcje przenikania żelu, dializowane w celu usunięcia guanidyny. Ścieżka 6: Silna wymiana anionów i późniejsza chromatografia oddziaływań hydrofobowych. Ścieżka 7: Chromatografia na hydroksyapatycie. Pasmo SDS-PAGE z etapu chromatografii hydroksyapatytowej sekwencjonowano za pomocą tandemowej spektroskopii masowej. Zidentyfikowano osiemnaście peptydów trypsyny, które odpowiadały przewidywanym sekwencjom z przypuszczalnej flageliny S. dysenteriae, fliCSD (National Center for Biotechnology Information, informacja 442483). Jedenaście z tych peptydów było identycznych z odpowiednimi sekwencjami przewidywanymi z fliCSD; reszta miała pojedyncze substytucje aminokwasowe. Żaden ze zidentyfikowanych peptydów nie pasował do przewidywanych sekwencji peptydowych flageliny z E. coli K-12 (produkt genu fliC, akcesja 120319). Wieńce z EAEC powodują uwalnianie IL-8 z komórek Caco-2. Aby zweryfikować, że zidentyfikowana flagelina rzeczywiście była białkiem uwalniającym IL-8. z 042, przygotowaliśmy flagellę z EAEC 042 (Figura 3). Przecięliśmy pasma o wyższym i niższym ciężarze cząsteczkowym z żelu, wymyliśmy białka do wody przez dyfuzję i dokładnie je dializowaliśmy, aby usunąć SDS. Mniejsze białka nie powodowały uwalniania IL-8, podczas gdy białko o około 65 kDa (dalej określane jako FliC-EAEC) było wyjątkowo silne, ze specyficzną aktywnością około 333 U / yg, co odpowiada połowie maksymalnej aktywności przy około 10. 10 M. Ponadto, gdy wici hodowlane EAEC traktowano przy pH 3,0, a następnie zobojętniano, nadal były aktywne i zachowywały swoją mobilność i charakterystykę barwienia na SDS-PAGE (nie pokazano). Sugeruje to, że depolimeryzowane wici (składające się w znacznym stopniu z białka flageliny) są tak aktywne jak nienaruszone wici, a zatem sama flagelina odpowiada za uwalnianie IL-8. Podobnie jak w przypadku supernatantów hodowli EAEC, dodanie polimyksyny B (10 .g / ml) do komórek Caco-2 nie zmniejszyło efektu uwalniania IL-8. flageliny EAEC, co sugeruje, że LPS nie przyczynił się do tego efektu. Figura 3Gel (9% SDS-PAGE) izolacji wiciowej EAEC. Próbki zatężono przed wyładowaniem za pomocą wytrącania acetonem. Ścieżka 1: Flagella ścinano z EAEC 042 i granulowano przez ultrawirowanie. Ścieżka 2: Pasmo około 65 kDa, wycięte i wymyte z poprzedniego żelu, dializowane w celu usunięcia SDS i reVrun w buforze ładującym zawierającym SDS. Ścieżka 3: Pasmo o wielkości około 35 kDa podobnie wyeluowano, dializowano i powtórzono. Specyficzną aktywność zdefiniowano jako ilość próbki wytwarzającej połowę maksymalnego uwalniania IL-8 z komórek Caco-2 po 3 godzinach ekspozycji. Zbadano kilka dodatkowych szczepów bakterii na obecność wici uwalniającej IL-8 (Tabela 1). Nie stwierdzono wykrywalnego uwalniania IL-8 w komórkach Caco-2 przez dodanie 50. L wiciowego roztworu (0,5. 5,0. G / dołek) z GDI 20 (niepatogennego ludzkiego izolatu z Brazylii), Vibrio cholerae, C1845 ( dyfuzyjnie przylegającą E. coli) lub BL21. Przeciwnie, prozapalne wici wykryto w ośmiu z dziesięciu izolatów EAEC z różnych źródeł, jak również enterohemorrhagicznych E. coli O157: H7 i enteropatogennych E. coli E2348. Co ciekawe, wystąpiło dysocjowanie między reaktywnością z surowicą H18 i uwalnianiem IL-8, co sugeruje, że epitopy H antygenowe na FliC-EAEC mogą być oddzielone od regionów cząsteczki odpowiedzialnej za aktywność prozapalną. Aflagellar EAEC 042 nie powoduje uwalniania IL-8. Aby określić, czy ekspresja wici jest niezbędna, aby 042 powodowało uwalnianie IL-8, użyliśmy wewnętrznego fragmentu fliC o 588 bp do bezpośredniego wstawienia wektora samobójczego R6K pJP5603 do genu flageliny EAEC 042 (fliCEAEC)
[hasła pokrewne: podchloryn sodu dawkowanie, bartnik bielsko, wrzodziejące zapalenie jelita grubego dieta ]
[podobne: przychodnia bielsko komorowicka, ostry dyzur okulistyczny, klinika stomatologiczna łódź ]