Enteroagregacyjna Escherichia coli wyraża nową flagelinę, która powoduje uwalnianie IL-8 z komórek nabłonka jelitowego

Enteroaggregative Escherichia coli (EAEC) jest nową przyczyną ostrej i uporczywej biegunki na całym świecie. Zakażenia EAEC są związane z zapaleniem jelit i zaburzeniami wzrostu u zakażonych dzieci, nawet przy braku biegunki. Wcześniej donieśliśmy, że prototypowe szczepy EAEC szybko indukują wytwarzanie IL-8 przez komórki nabłonka jelita Caco-2, i że w tym działaniu pośredniczy rozpuszczalny, stabilny cieplnie czynnik uwalniany przez te bakterie w hodowli. Przedstawiono tutaj klonowanie, sekwencjonowanie i ekspresję tego biologicznie czynnego czynnika uwalniającego IL-8a z EAEC i jego identyfikację jako flageliny, która jest unikalna wśród znanych białek ulegających ekspresji. Wici oczyszczone z EAEC 042 i kilku innych izolatów EAEC silnie uwalniają IL-8 z komórek Caco-2; inżynierowany mutant aflagellarny 042 nie uwalnia IL-8. Na koniec sklonowana flagelina EAEC eksprymowana w niepatogennej E. coli jako białko fuzyjne znakowane polihistydyną zachowuje aktywność prozapalną. Odkrycia te wskazują na nowe istotne metody, dzięki którym EAEC może powodować zapalenie jelit, uporczywą biegunkę i zaburzenia wzrostu, które charakteryzują zakażenie ludzi tymi organizmami. Ponadto otwierają nowe podejścia do diagnozy i opracowywania szczepionek. Ten nowy patogenny mechanizm EAEC rozszerza powstający paradygmat wici bakteryjnej jako bodźców zapalnych. Wprowadzenie Termin enteroagregacyjny Escherichia coli (EAEC) odnosi się do heterogennej grupy bakterii zdefiniowanej za pomocą testu fenotypowego, agregacyjnej (lub. Sklejanej.) Adherencji do komórek HEp-2 w hodowli. Od czasu, gdy po raz pierwszy opisano go w 1987 r., EWEA stała się główną przyczyną utrzymującej się biegunki u dzieci w wielu rozwijających się obszarach (1, 2). Ostatnio w krajach rozwiniętych zidentyfikowano EWEA, powodując ostrą, przewlekłą lub przewlekłą biegunkę u podróżnych (3, 4), pacjentów z AIDS (5) i dzieci uczęszczających do przedszkoli (6), a występującą w dużych pożywieniu – ogniska wywołane przez rośliny (7). Oprócz wywoływania biegunki, infekcje u dzieci z zakażeniem EAEC wiążą się z niedoborem wzrostu i zapaleniem jelit, nawet u dzieci bez biegunki (8). W tym kontekście ostatnio udokumentowaliśmy, że biegunka wczesnego dzieciństwa koreluje z długotrwałymi deficytami wzrostu, sprawności fizycznej i funkcji poznawczych (9). Długoterminowe skutki infekcji EAEC na wzrost i rozwój dzieci w obszarach rozwijających się mogą być nawet ważniejsze niż krótkoterminowa zachorowalność związana z biegunką. Na podstawie naszych badań klinicznych pokazujących dowody zapalenia jelit z zakażeniem EAEC u dzieci w Brazylii, opisaliśmy prozapalną aktywność supernatantów hodowli EAEC, w której pośredniczy domniemane białko, które powoduje szybkie uwalnianie IL-8 chemokiny neutrofili z ludzkiego okrężnicy Caco-2 komórki rakowe (8). Tutaj opisujemy oczyszczanie, klonowanie, ekspresję i identyfikację tego białka jako flageliny unikalnej wśród znanych białek wiciowej E. coli, ale homologicznej do niewyrażonej flagelliny z Shigella dysenteriae. To odkrycie generuje nowy paradygmat patogenezy jelitowej E. coli. Metody Hodowla komórkowa i uwalnianie IL-8. Odczynniki do hodowli komórkowej otrzymano z GIBCO BRL (Bethesda, Maryland, USA), o ile nie podano inaczej. Komórki ludzkiego raka okrężnicy Caco-2 otrzymano z Cynthia Sears (Johns Hopkins University, Baltimore, Maryland, USA) i hodowano jak opisano (8). CCD-18Co ludzkie fibroblasty okrężnicy otrzymano z American Type Culture Collection (Rockville, Maryland, USA) i hodowano w MEM z 2 mM L-glutaminy, 1,5 g / l NaHCO3, mM pirogronianu sodu, 0,1 mM nieistotnego roztworu aminokwasów , 100 U / ml penicyliny, 100 ug / ml siarczanu streptomycyny i 10% FBS. Fibroblasty były seryjnie pasażowane przy użyciu 0,25% trypsyny i mM EDTA. Komórki ludzkiego raka okrężnicy T84 otrzymano z American Type Culture Collection i hodowano w 50% DMEM i 50% Sall F12 z dodatkiem 15 mM HEPES, 26 mM NaHCO3, 5% FBS, 100 U / ml penicyliny i 100 (ig. / mL siarczanu streptomycyny; pasażowano je przy użyciu 1% trypsyny / mM EDTA. Dla testów uwalniania IL-8, komórki zaszczepione przy gęstości 500 000 na dołek na 24-studzienkowe płytki z polistyrenu zastosowano po 5. 14 dniach. Bakterie lub produkty bakteryjne, które mają być testowane, dodano do 500 .l pożywki wzrostowej w każdej studzience. Po 3 godzinach inkubacji w 37 ° C w atmosferze 5% CO2, pożywkę usunięto i testowano na stężenie IL-8 metodą immunoenzymatyczną (Quantikine IL-8; R & D Systems, Minneapolis, Minnesota, USA). Jedna jednostka aktywności została zdefiniowana jako ilość białka, które wytworzyło połowę maksymalnego uwalniania IL-8
[hasła pokrewne: centrum pszczelarskie łysoń, klinika stomatologiczna łódź, wieniec zdrój sanatorium hutnik ]
[hasła pokrewne: przeszczep szpiku kostnego, gorvita zielony jęczmień opinie, łysoń sklep ]