Mutacje w kinazie białkowej A R1 Podjednostka regulacyjna powoduje rodzinną postać szpiczaka serologicznego i kompleks Carneya ad

Dalej proponujemy PRKAR1. działa jako gen supresorowy guza w celu regulacji proliferacji komórek w ludzkim sercu. Metody Ocena kliniczna. Uzyskano świadomą zgodę wszystkich uczestników zgodnie z Wyższą Szkołą Medyczną Weill Medical College of Cornell University. Wszyscy członkowie rodziny byli oceniani przez dokładną historię i badanie fizyczne bez znajomości statusu genotypu. Jeśli wystąpiły jakiekolwiek objawy choroby dermatologicznej, sercowej lub endokrynologicznej sugerujące kompleks Carneya, pacjenci byli dalej oceniani za pomocą elektrokardiografii, echokardiografii przezklatkowej i chemii surowicy. Analizy genetyczne. Krew obwodową uzyskano od każdego członka rodziny, a linie limfoblastoidalne ustalono przez transformację wirusem Epsteina-Barr (8). Genomowe DNA i RNA wyizolowano z obwodowych limfocytów, limfoblastów lub komórek nowotworowych za pomocą kolumn QIAamp (QIAGEN Inc., Valencia, California, USA). Polimorficzne krótkie powtórzenia tandemowe (STR) amplifikowano za pomocą PCR z opublikowanymi nukleotydowymi sekwencjami starterów (10), analizowano na denaturujących żelach poliakryloamidowych (8) i wizualizowano za pomocą autoradiografii lub w sekwenatorze ABI 377 (Perkin-Elmer Inc., Norwalk, Connecticut, USA). USA). Analizę cytogenetyczną próbek nowotworu i limfocytów wykonano zgodnie z wcześniejszym opisem (11). Klonowanie i analiza sekwencji GNAS13. Oligonukleotydy (5a-CTATTCTGCATGACAACCTGAAGC-3 (3 / 5a-TCTAATTCTGGTTGTAAACTGCTA-3a) odpowiadające 3. część genu GNAS13 (12), w tym nieulegającą translacji sekwencji, użyto do przesiewania, za pomocą PCR, szykowanych puli biblioteki ludzkiego genomowego PAC Roswell Park Cancer Institute (Buffalo, New York, USA). Te oligonukleotydy zastosowano również do amplifikacji segmentu genu GNAS13 z ludzkiego genomowego DNA. Produkt ten był losowo znakowany izomeriem heksameru i wykorzystywany jako sonda do przesiewania macierzy membranowej ludzkiej genomowej biblioteki BAC Roswell Park Cancer Institute. DNA BAC i PAC przygotowano z zestawem QIAGEN Large Construct (QIAGEN Inc.) i sekwencjonowano bezpośrednio za pomocą oligonukleotydów losowo zaprojektowanych z sekwencji kodującej GNAS13 na sekwenatorze ABI 377 (Perkin-Elmer Inc.). Startery zaprojektowano w następujący sposób z eksonów 2, 3 i 4 z sekwencją elektronów intronowych, Exon 2: 5. -GAGTCAGTTCGCTGGTTCC-3. / 5. -TGCCCTTAACCCCGGCCCCATTC-3. Exon 3: 5. -AAGGTTTGTCTAGGTTAATTC-3. / 5. -TAGCCTTTCAGTCTGTTCCTCCA-3. Exon 4: 5. -GAGTCAGTTCGCTGGTTCC-3. / 5. -TGCCCTTAACCCCGGCCCCATTC-3. Ekson 5 amplifikowano w dwóch zachodzących na siebie segmentach przy użyciu par primerów: 5 (3-AGGCATGACCACCATGTCTGACCA-3. / 5. -GATTGGTCAGTCGATCTTCCA-3. 5. -GTTTCGACAGTGTGACATCAATAC-3. / 5. -TCTAATTCTGGTTGTAAACTGCTA-3. Każdy ekson amplifikowano PCR z odpowiednią parą starterów z próbek ludzkiego genomowego DNA w warunkach reakcji w następujący sposób: [94 ° C x 20 s, 57 ° C x 30 s, 72 ° C x 45 s] x 35 cykli. We wszystkich przypadkach z wyjątkiem amplifikacji eksonów 2 zastosowano standardowe odczynniki do PCR z AmpliTaq Gold (Perkin-Elmer Inc.). Exon 2 amplifikowano za pomocą zestawu QIAGEN Taq DNA Polymerase Kit (QIAGEN Inc.). Amplifikowane produkty sekwencjonowano w obu kierunkach za pomocą automatycznego sekwenatora ABI 377, stosując odczynniki BigDye Terminator Cycle Sequencing (Perkin-Elmer Inc.). PRKAR1. analiza sekwencji. Oligonukleotydy (jak poniżej) zaprojektowano w oparciu o sekwencję intronową otaczającą każdy PRKAR1. ekson (3-11) i zostały użyte do amplifikacji PCR z próbek ludzkiego genomowego DNA. Warunki PCR były następujące: [94 ° C x 20 s, 57 ° C x 30 s, 72 ° C x 45 s] × 35 cykli przy użyciu standardowych odczynników PCR i AmpliTaq Gold (Perkin-Elmer Inc.). Exon 3: 5. -GAATTGGTGTTTTCCTCTTAACTT-3. / 5. -TATGATTCATTCATCAAAGGAGAC-3. Exon 4: 5. -AATGTTTTTGGTTTATGGAATTGT-3. / 5. -CACACCCTTACTTGAAAAATAGTG-3. Exon 5: 5. -GACAGTCTGGGGTCTTTAATTCTA-3. / 5. -TCAAAGAGGAAAACAAACTTCAAT-3. Exon 6: 5. -TTTCTTTAATTTGGAATATGCTTC-3. / 5. -ATCTGACATACAAGGGATGTAATG-3. Exon 7: 5. -TTTTTAAAACAAAGTTCAGGATTG-3. / 5. -CTAAATCACACTCTCAAACACCAT-3. Exon 8: 5. -ATTATTCCATAGCATTATGTGGTG-3. / 5. -AGTCACAGAGGAAATAACTGTGAA-3. Exon 9: 5. -GGCTATTTGTTGAATCTCTTTAT-3. / 5. -TGAGTTCTTTACCTCTAAAATTCAA-3. Exon 10: 5. -TTGTTTAGCTTTTTGG GATTTTA-3. / 5. GGAGAAGACAAAA TATGGAAGAC-3. Exon 11: 5. -TATTGTCTTCTTTCTCAGAAGTGC-3. / 5. -GTGCAATAAAAGCAACTTTCAATA-3. Egzony i 2 zamplifikowano za pomocą RT-PCR z próbek limfocytów pacjenta lub RNA z limfoblastów za pomocą zestawu Access RT-PCR (Promega Corp., Madison, Wisconsin, USA) i primerów: 5a-GCTGGGAGCAAAGCGCTGAGGGA-3. / 5. -TGTAGACCTCAGCGCTGATAGC-3. Amplifikowane produkty sekwencjonowano w obu kierunkach za pomocą automatycznego sekwenatora ABI 377, stosując odczynniki BigDye Terminator Cycle Sequencing (Perkin-Elmer Inc.). Dwie nowe STR, powtórzenie dinukleotydu AG28 i powtórzenie trinukleotydu ATT11, odnotowano w PRKAR1. 5. nieprzetłumaczony region i 21 kb 3. odpowiednio do genu
[hasła pokrewne: gorvita zielony jęczmień opinie, przeszczep szpiku kostnego, łysoń sklep ]
[przypisy: klinika stomatologiczna łódź, carcinoma adenoides cysticum, operacje plastyczne dr szczyt ]