Mutacje w kinazie białkowej A R1 Podjednostka regulacyjna powoduje rodzinną postać szpiczaka serologicznego i kompleks Carneya cd

Startery do PCR użyte do powielenia przy użyciu tych powtórzeń do badań genotypowych były następujące: AG: 5 (3 -CTGCAGGAAGAGGGAGAAATGGGAA-3. / 5. -AGAAGTTAAGTGACTTGCCCATGGC-3. ATT: 5. -TTTCAGCCTCAGTATCTTTATTTG-3. / 5. -ACCTAAAGTCTTTCTGCCAGTTAT-3. Analiza Western blot. Próbki limfoblastu i guza solubilizowano w 2% SDS. Równoważne stężenia białka lizatu poddano elektroforezie na 10% żelu denaturującym akrylamid i przeniesiono na membranę PVDF. Western blotting przeprowadzono z użyciem anty-aktyny (Sigma Chemical Co., St Louis, Missouri, USA) i z pierwszorzędowymi mAb na R1. i R2. Podjednostki PKA (Becton Dickinson Transduction Laboratories, Lexington, Kentucky, USA). Epitopy antygenowe w podjednostkach regulatorowych PKA znajdują się w końcowym regionie zawiasowym NH2 (13), a dodatnimi kontrolami dostarczonymi przez Becton Dickinson Transduction Laboratories były szczurzy lizat mózgowy (R1a) i lizat śródbłonka ludzkiej aorty (R2a). Związane pierwotne przeciwciało wykrywano za pomocą ECL (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, New Jersey, USA). Densytometrię przeprowadzono przy użyciu systemu obrazowania Fluor-S i oprogramowania MultiAnalyst (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, California, USA). Odpowiednią ilość całkowitego białka komórkowego dla próbek limfoblastów załadowano na każdy żel, w oparciu o ekspresję aktyny. Jak oszacowano w odniesieniu do ekspresji aktyny, ilość białka komórkowego z lizatu mysiaka wynosiła 10% białka komórkowego lizatu limfoblastu. Wyniki Genetyczne i fizyczne mapowanie locus CAR. Nasze poprzednie analizy wykazały, że gen złożony z choroby Carneya znajduje się w 17-cM odstępie między D17S807 i D17S785. Analiza map genetycznych i fizycznych o wysokiej gęstości (10, 12) tego locus (ryc. 2) pozwoliła na dokładne uporządkowanie dziesięciu dodatkowych polimorfizmów mikrosatelitarnych (ryc. 2, tabela 1) w tym przedziale, które wykorzystano do genotypowania rodzin YA i YB . Analiza haplotypów ujawniła zdarzenia rekombinacji pomiędzy genem choroby złożonej z Carneya i D17S1882 i D17S929 na odpowiednio centromerowych i telomerowych końcach locus CAR. Tak więc, te analizy genetyczne udoskonaliły locus CAR i ustaliły minimalny odstęp genetyczny około 12 cM między D17S1882 i D17S929 dla locus CAR. Figura 2Ideogram chromosomu 17 z wzorcem prążków Giemsy pokazującym lokalizację locus kompleksu Carneya i PRKAR1. gen. Pasma dodatnie są czarne, a obszar pericentromeryczny szary. Liczby wskazują oznaczenia cytogenetyczne dla pasm. Przedstawiono lokalizację genetycznych map polimorficznych loci analizowanych z 17q. Wskazano jeden centimorgan (cM). Dane dotyczące połączenia sugerują, że gen odpowiadający za kompleks Carneya znajduje się w przedziale 12-cM między D17S1882 i D17S929 (CAR). Zarówno GNAS13, jak i PRKAR1. mapować cytogenetycznie do chromosomu 17q23-q24. Tabela Analiza heterotypów osobników w rodzinach dotkniętych kompleksem Carney Wyłączenie GNAS13. Skomputeryzowana analiza projektu ludzkiego genomu / bazy danych GenBank (12) ujawniła, że miejsce oznaczone tagami D17S2016 (STS) było zawarte w centromerowej części locus CAR. Analiza BLAST tego STS wykazała, że sekwencja odpowiada sekwencji kodującej genu GNAS13 (nr dostępu w GenBank L22075) kodującej białko GTP wiążące GTP. Mutacje w innym białku wiążącym GTP zaangażowane w wewnątrzkomórkowe przekazywanie sygnału, Gs (3, powodują zespół McCune-Albrighta, który ma kilka cech fenotypowych z kompleksem Carneya, w tym nieprawidłową pigmentację skóry i endokrynopatię (5), ale Gs. mutacje nie występują u pacjentów złożonych z Carney (14). Biorąc pod uwagę homologie między G13 a Gs. i lokalizację chromosomu genu GNAS13, szukaliśmy mutacji w genie GNAS13 u pięciu niespokrewnionych pacjentów złożonych z Carney. Przeanalizowaliśmy biblioteki ludzkiego DNA genomowego DNA Roswell Park Cancer Institute BAC i PAC i zidentyfikowaliśmy sześć klonów BAC (472J20, 484A6, 583F2, 489G5, 657B12, 752A23) i cztery klony PAC (704J11556, 704K19308, 704A09613, 704A10613) dla GNAS13. Porównanie sekwencji BAC / PAC z sekwencją cDNA GNAS13 ustaliło genomową strukturę ludzkiego genu GNAS13: 5 eksonów z otwartą ramką odczytu rozpoczynającą się w eksonie 2. Egzony 2 (5 (sekwencja kodująca GNAS13) zostały zamplifikowane z próbek DNA pacjentów i poddane automatyczne sekwencjonowanie. Chociaż trinukleotyd GGC7 STR w obrębie 5. nieulegająca translacji sekwencja w eksonie 2 GNAS13 (3 pz 5 (3 do miejsca początku translacji) okazała się polimorficzna, nie znaleziono mutacji w obrębie sekwencji kodującej GNAS13. Identyfikacja PRKAR1. mutacje. Przesłuchanie baz danych projektu Human Genome wykazało, że PRKAR1. gen (nr dostępu
[podobne: bartnik bielsko, bartnik pl, sklep łysoń ]
[patrz też: finasteryd skutki uboczne, dom latających sztyletów cda, depilacja brazylijska poznań ]