Nadekspresja syntazy prostacyklinowej u myszy transgenicznych chroni przed rozwojem hipoksycznego nadciśnienia płucnego ad

PGI2 w aerozolu zmniejsza nadciśnienie płucne i przetokę oraz poprawia utlenowanie tętnicze w przypadku braku działań ogólnoustrojowych u pacjentów z ciężkim zapaleniem płuc (20); ta forma terapii jest tak samo skuteczna jak wziewny tlenek azotu u pacjentów z ostrym zespołem niewydolności oddechowej (21). W zwierzęcym modelu niewydolności oddechowej z nadciśnieniem płucnym, wziewna prostacyklina (działająca transepitellalnie z selektywnością płucną) przewyższała dożylną prostacyklinę w poprawianiu utleniania i hemodynamice płucnej (22). Celem niniejszego badania było zbadanie roli nadprodukcji płucnej prostacykliny na rozwój nadciśnienia płucnego za pomocą transgenicznej myszy, która została opracowana do selektywnej nadekspresji PGIS w komórkach nabłonka płucnego. Aby określić biologiczny wpływ nadekspresji PGIS, zwierzęta były narażone na przewlekłe niedotlenienie i przeprowadzono ocenę ciśnienia w prawej komorze i przebudowy naczyń płucnych. Wykazujemy, że nadekspresja PGIS zapobiega płuczkowej remodelacji naczyniowej z powodu przewlekłego niedotlenienia. Metody Konstrukcja transgenu SP-C / PGIS. Używając kombinacji PCR i standardowego skriningu biblioteki hybrydyzacyjnej, określiliśmy całą sekwencję kodującą dla szczurzego cDNA PGIS. Ta sekwencja nukleotydów została przekazana do GenBank / EMBL z numerem dostępu. U53855. Region kodujący szczurzego cDNA PGIS wykazuje 82% homologii z sekwencją bydlęcą (9, 10) i 82,5% homologii z cDNA ludzkim (11). Pełnej długości cDNA dla PGIS szczura zamplifikowano za pomocą PCR z biblioteki cDNA-pęd strutującego płuca płuca zbudowanej w wektorze gtlll (CLONTECH Laboratories Inc., Palo Alto, California, USA) z użyciem wysokiej jakości polimerazy DNA pfu. (Stratagene, La Jolla, Kalifornia, USA) ze starterami PCR, które obejmują kodony startowe (5 -CTG GAA TTC CGG GAG CCA TG-3a) i stop (5 -ACTT GTC TGC TCC ACA GGT CA-3a) cDNA PGIS. Całkowitą otwartą ramkę odczytu wykazano za pomocą analizy sekwencji. Centrum Sekwencjonowania DNA Uniwersytetu w Colorado w Cancer Center przeprowadziło automatyczne sekwencjonowanie, używając sekwencerów Applied Biosystems 377 i 373. (Perkins-Elmer, Foster City, Kalifornia, USA). Plazmid 3,7 hSP-C / SV-40 był hojnym darem od Jeffreya A. Whitsetta (Children s Hospital Medical Center, Cincinnati, Ohio, USA). Ten plazmid pUC18 zawiera sekwencję flankującą 3,7 kb ludzkiego promotora SP-C, oprócz małego intronu T SV-40, jako sygnał poliadenylacji (23, 24). Udowodniono, że ten konstrukt eksprymuje transgenów w dystalnej części nabłonka płuc i wyłącznie pęcherzyków płucnych (24). Szczurzy cDNA PGIS sklonowano w miejscu SalI / EcoRI plazmidu, tworząc gen fuzyjny cDNA promotor SP-C-PGIS (Figura 1). Właściwa orientacja klonowania naszego konstruktu została potwierdzona przez bezpośrednią analizę sekwencji. Figura HUMAN SP-C / konstrukt transgenu szczurzego PGIS. Wskazano odpowiednie miejsca restrykcyjne stosowane w klonowaniu. Mały T intron SV-40 jest wykorzystywany jako specyficzna dla genu sonda do analizy Northern, blottingu Southerna i hybrydyzacji in situ. Generowanie i identyfikacja myszy transgenicznych. DNA zawierający transgen przygotowano do zastrzyków przedjądrzykowych, jak opisano (25). Jon Neumann (University of Cincinnati Transgenic Mouse Core Facility, Cincinnati, Ohio, USA) wykonał zastrzyki przedjądrzykowe. Ogółem wykonano 600 jednojądrzastych iniekcji u myszy FVB / N, uzyskując 40 szczeniąt. Identyfikacja potomstwa transgenicznego (myszy-założycieli) została przeprowadzona przez analizę genomowego DNA wyizolowanego z biopsji ogonowych za pomocą zestawu tkankowego QIAamp zgodnie z protokołami producenta (QIAGEN Inc., Santa Clarita, Kalifornia, USA). Analiza PCR genomowego DNA została przeprowadzona przy użyciu, jako kontroli, starterów z TSH-a. gen zapewniający jakość genomowego DNA (primer sensowny: 5. -TCC TCA AAG ATG CTC ATT AG-3 ., antysensowny starter: 5. -GTA ACT CAC TCA TGC AAA GT-3.). Startery obejmujące odcinek o wielkości 400 pz małego intronu T-SV-40 zaprojektowano w celu wykrycia obecności transgenu (primer sensowny: antysensowny primer 5: 3-TGT GAA GGA ACC TTA CTT CTG TGG-3 (3: 5 (3 -TGG ACA AAC CAC AAC TAG AAT GCA-C-3.). Badanie 40 szczurów z 600 zastrzyków przedjądrzyowych wykazało identyfikację 7 szczeniąt jako założycieli. W celu utrzymania szczepu izogenicznego wszystkie myszy namnażano jako heterozygotyczne myszy transgeniczne przez hodowlę z myszami FVB / N typu dzikiego. Myszy FVB / N wybrano ze względu na powiększenie przedjądrza męskiego w tym szczepie i wynikową względną łatwość mikroiniekcji. Myszy z generacji F2 były używane we wszystkich badaniach. Analiza Southern blot. Aby potwierdzić wyniki PCR i zidentyfikować transgeniczne myszy z transgenem PGIS, genomowe DNA wyizolowano jak opisano powyżej, strawiono EcoRI, rozdzielono na 0,9% żelu agarozowym i przeniesiono na błonę Nytran (Schleicher & Schuell Inc., Keene, New Hampshire , USA)
[patrz też: płatki owsiane na wodzie, carcinoma adenoides cysticum, objawy refluksu u dzieci ]
[więcej w: podchloryn sodu dawkowanie, wrzodziejące zapalenie jelita grubego dieta, przeszczep szpiku kostnego ]