Nadekspresja syntazy prostacyklinowej u myszy transgenicznych chroni przed rozwojem hipoksycznego nadciśnienia płucnego cd

Kleksy suszono powietrzem i pieczono. Hybrydyzację przeprowadzono stosując znakowaną 32P sondę produktu o wielkości 400 bp małego intronu T SV-40 wytworzonego z opisanych tutaj starterów, przy użyciu ExpressHyb (CLONTECH Laboratories Inc.) zgodnie ze specyfikacjami producenta. Blot wystawiono na działanie filmu Kodak XAR w temperaturze około 80 ° C. Analiza Northern blot. Zwierzęta uśmiercano przez śmiertelne wstrzyknięcie 50 mg pentobarbitalu sodu (Abbott Laboratories, North Chicago, Illinois, USA). Płuca natychmiast zamrożono w łaźni z etanolem / suchym lodem i przechowywano w temperaturze około 70 ° C. Całkowity RNA ekstrahowano przy użyciu Tri-Reagent (Molecular Research Center, Cincinnati, Ohio, USA) zgodnie z protokołem producenta. Stężenie każdej próbki określono na podstawie absorbancji przy 260 nm (A260). Czystość każdej próbki określono na podstawie stosunku A260 do A280 (A260: 280). Zakres 1,6. 2,0 został uznany za wystarczająco czysty. Całkowity RNA (20 .g / ścieżkę) rozdzielono zgodnie z rozmiarem na 1% żelu agarozowym / 0,6 M formaldehydu i przeniesiono na syntetyczną membranę (Maximum Strength Nytran Plus, Schleicher & Schuell Inc.), stosując standardową technikę kapilarną. Hybrydyzację, przemywanie i autoradiografię przeprowadzono jak opisano dla analizy Southern. Następnie wszystkie membrany poddano strippingowi i sondowano p-aktyną jako kontrolami, aby zapewnić równe obciążenie i przeniesienie. Autoradiografy analizowano przy użyciu oprogramowania do analizy żeli SigmaGel (Jandel Scientific, San Rafael, California, USA). Hybrydyzacja in situ. Świeżą tkankę płuc napompowano agarozą o niskiej temperaturze topnienia i zamrożono jak opisano wcześniej (26). Zamrożone skrawki tkanki płucnej poddano następnie wykrywaniu antygenu T SV-40 przez hybrydyzację in situ (27). Mały intron SV-40 amplifikowano przez PCR jak opisano poprzednio i klonowano do wektora pGEM T (Promega Corp., Madison, Wisconsin, USA). Znane antysensowne i sensowne sondy cRNA znakowane digoksygeniną zsyntetyzowano odpowiednio z promotorów polimerazy T7 i SP6 (zestaw Genius IV, Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, Indiana, USA). Sondy antysensowne i sensowne zastosowano w równoległych sekcjach w obrębie tych samych szkiełek po 2 ng / ml, a następnie hybrydyzowano w temperaturze 37 ° C przez noc. Wykrywanie produktu hybrydyzacji kontynuowano przez około 4 godziny. Dwa slajdy płuc na zwierzę badano przez hybrydyzację in situ. 6-keto PGF1. test na aktywność PGIS. Płuca z obu Tg + i Tg. zwierzęta ważono i homogenizowano w buforze zawierającym zbalansowany roztwór soli Earle a (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA) i 0,1% BSA. AA (3 .g / ml) dodano do próbki, którą następnie rozcieńczono 1: 3 metanolem. Stosując metody opisane uprzednio (28), zbadaliśmy homogenaty płuc w celu określenia 6-keto PGF1. poziomy w płucach. Test przeprowadzono w sposób zaślepiony (przez JY Westcott) z użyciem kodowanych probówek. Ostra ekspozycja niedotlenienia. W przypadku ekspozycji na ostrą hipoksję, samce myszy w wieku 10-12 tygodni umieszczano w komorze akrylowej (FIO2 = 0,1) na 15 minut. Podczas oceny hemodynamicznej zwierzęta utrzymywano w środowisku niedotlenionym (z wyjątkiem krótkiego okresu podawania anestezji) przez umieszczenie ich w cylindrze z przepływowym tlenem przy FIO2 = 0,1. W przypadku tych badań 14 Tg. badano 10 zwierząt Tg +. Ekspozycja na niedotlenienie hipobaryczne. W przypadku ekspozycji na niedotlenienie hypobaryczne, myszy płci męskiej w wieku 12 tygodni trzymano w komorze z obniżoną krwią przez 5 tygodni na symulowanej wysokości 17 000 stóp (Pb = 410 mmHg, inspirowane PO2 = 76 mmHg). Pięć zwierząt Tg + i 5 Tg. Do tych badań wykorzystano mioty. Ekspozycja była ciągła, z przerwą trwającą mniej niż godzinę dziennie dla zwierząt. Ocena hemodynamiczna. Bezpośrednie ciśnienie skurczowe prawej komory (RVSP) mierzono zgodnie z wcześniejszym opisem (29). Pokrótce, zwierzęta znieczulono ketaminą i ksylazyną (odpowiednio 100 mg / kg i 15 mg / kg) za pomocą wstrzyknięcia domięśniowego z tyłu. Po odpowiedniej sedacji zwierzęta umieszczono w pozycji leżącej na plecach, oddychając powietrzem w pomieszczeniu. Przetwornik ciśnienia został skalibrowany do punktu zerowego w środkowej przedniej części klatki piersiowej. Igła 26-gie została wprowadzona przezskórnie do klatki piersiowej za pomocą podejścia subksferowego. Ciśnienie prawej i lewej komory mierzono za pomocą przetwornika ciśnienia (Gulton-Statham, Costa Mesa, Kalifornia, USA) i rejestrowano na rejestratorze wielokanałowym (Grass Instruments, Quincy, Massachusetts, USA). Wykonano około 10 nagrań na zwierzę. Po pomiarze hemodynamicznym zwierzęta uśmiercono, a tkanki utrwalono do analizy morfometrycznej. Analiza hematokrytu
[hasła pokrewne: czym słodzić zamiast cukru, jak zakończyć karmienie piersią, ostry dyzur okulistyczny ]
[podobne: gorvita zielony jęczmień opinie, łysoń sklep, sklep łysoń ]