Ocena aktywności choroby w dystrofiach mięśniowych za pomocą nieinwazyjnego obrazowania ad 7

Mięśnie kończyn tylnych zanurzono w 0,5% PFA na 5 godzin, a następnie odwadniano w 20% sacharozie przez noc w 4 ° C. Mięśnie następnie zanurzono w OCT (Sakura Finetek USA Inc.) i zamrożono przez około 30 sekund w ciekłym azocie chłodzonym w izopentanie. Krioskrawki mięśni (o grubości 8 .m) umieszczono na powlekanych szklanych szkiełkach, które następnie przetwarzano pod kątem barwienia histologicznego lub immunohistologicznego. Przeciwciała użyte w tym badaniu były następujące: kurczak anti-syndekan-4 (1: 1000, dar od Bradleya Olwina (University of Colorado, Boulder, Colorado, USA), antylaminina królika (1: 1000, Sigma-Aldrich L9393 ), mysia anty-lucyferaza (1: 1000, Sigma-Aldrich L2164) i mysi anty-eMyHc (1: 100; DSHB klon F1.652-s) .Biolcyferazowe oznaczenie biochemiczne Myszy uśmiercano jak opisano powyżej, i mięśnie były zważono bezpośrednio po izolacji, następnie mięśnie umieszczono w 5 ml roztworu kolagenazy II o stężeniu 2 mg / ml na godzinę w temperaturze 37 ° C z mieszaniem, po czym macerowano mięśnie i próbki odwirowano, supernatanty odessano, a tkanka mięśniowa została poddana lizie zgodnie z instrukcjami producenta systemu kontroli lucyferazy (Promega Inc.) Izolacja komórek satelitarnych: myszy zostały poddane eutanazji i zebrano mięśnie tylnych kończyn Mięśnie ponownie zawieszono w 0,2% kolagenazie II i trawiono przez godzinę. godzinę i 45 minut, po czym zawiesinę mięśniową roztarto na proszek Jestem całkowicie zdysocjowany. Mięśnie następnie poddano drugiemu trawieniu w 0,5% kolagenazie II i 1% dyspersji przez dodatkowe pół godziny. Komórki satelitarne oddzielono od włókien, przepuszczając trawiony mięsień za pomocą igły 20 G. Następnie komórki zebrano przez odwirowanie przy 183,7 gi ponownie zawieszono w 500 ul pożywki Ham F-10 (Mediatech Inc.). Zawiesinę komórek inkubowano z następującymi pierwszorzędowymi przeciwciałami: znakowany biotyną VCAM (CD106), FITC-CD45, FITC-CD31 i FITC-Sca1 (1/100; BD Biosciences. Pharmingen) przez 45 minut w 4 ° C na platforma do wytrząsania. Komórki następnie dokładnie przemyto i inkubowano z mikrokulkami anty-FITC (1/10; MACS Miltenyi Biotec) przez 15 minut. Komórki następnie umieszczono w maszynie do oddzielania komórek AutoMACS zgodnie z instrukcjami producenta (MACS Miltenyi Biotec). Komórki, które nie były FITC-dodatnie, inkubowano następnie z mikrobękami antybiotynowymi przez 15 minut (1/10, MACS Miltenyi Biotec) i ponownie poddano rozdziałowi MACS zgodnie z instrukcjami producenta. Komórki zliczano i wysiewano na szkiełka mikroskopowe powlekane ECM (1/1000, Sigma-Aldrich) (Lab Tek II, Fisher Scientific) i inkubowano w 37 ° C do utrwalenia. Statystyka. Wszystkie dane ilościowe są reprezentowane jako średnie, a słupki błędu wskazują SEM. Dane poddano dwukierunkowemu testowi Manna-Whitneya (do analizy postępu choroby porównując myszy typu dzikiego do myszy z niedoborem dysferliny) lub 2-ogonowe testy Student (przy porównywaniu męskich i żeńskich danych obrazowych, bliższej i tylnej kończyny tylnej, i oceny ilościowe z analiz histologicznych) w celu określenia znaczenia obliczonych różnic. Różnice te uznano za statystycznie istotne przy P <0,05. Zatwierdzenie badania. Zwierzęta były trzymane i trzymane zgodnie z wytycznymi określonymi przez Weterynaryjną Jednostkę Medyczną Systemu Opieki Zdrowotnej VA Palo Alto, a wszystkie procedury zostały wcześniej zatwierdzone przez IACUC przed ich wykonaniem. Materiały uzupełniające Zobacz dane uzupełniające Podziękowania Chcielibyśmy podziękować Charlesowi Kellerowi za jego doniosły wkład w dziedzinę w zakresie generowania transgenicznych szczepów myszy, które były używane w tych badaniach i które my i inni okazali się tak cenni w badaniach nad mięśniami. biologia komórek macierzystych i badania chorób mięśni. Praca ta była wspierana przez granty od Jain Foundation i NIH (Director s s Pioneer Award DP1 OD000392) do TA Rando. Przypisy Konflikt interesów: Autorzy zadeklarowali brak konfliktu interesów. Informacje referencyjne: J Clin Invest. 2013; 123 (5): 2298. 2305. doi: 10,1172 / JCI68458. Zobacz pokrewny artykuł w: Regeneracja świetlna: nieinwazyjne obrazowanie progresji choroby w dystrofii mięśniowej. [hasła pokrewne: sprzęt pszczelarski łysoń, depilacja brazylijska poznań, podchloryn sodu dawkowanie ] [więcej w: łysoń sklep, sklep łysoń, bartnik pl ]