Pdx1 przywraca funkcja komórek w myszach z nokautem Irs2 cd

Dla każdej próbki, porównano trzykrotne wartości ekspresji genów z krzywymi standardowego rozcieńczenia cDNA dla wysepek typu dzikiego rozcieńczeń log4 (nierozcieńczonych, 1: 4, 1:16, 1:64) przeprowadzonych w trzech powtórzeniach (cykl progowy Pdx1 (Ct) = 23, r2 = 0,99, Hnf1aCt = 28, r2 = 0,96, Hnf1aCt = 29, r2 = 0,88, Hnf3aCt = 27, r2 = 0,95, Hnf4aCt = 29, r2 = 0,99, cyklofilina Ct = 21, r2 = 0,98). Względne ilości produktu genu podano jako średnie. SEM kilku zwierząt dla każdego genu w porównaniu z cyklofiliną (typu dzikiego, n = 4, Irs1a / a, n = 2, Irs2a / a, n = 5). W analizie Western blot lizaty wysepek białkowych SDS wyrównano pod względem obciążenia za pomocą całkowitego oznaczenia białka (Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois, USA) prowadzonego na 12% SDS-PAGE, przeniesiono na membranę nitrocelulozową Protan (Schleicher & Schuell Inc., Keene, New Hampshire, USA), inkubowano z króliczymi anty-N-końcowymi surowicami odpornościowymi Pdx1 (z CVE Wright) i skoniugowanymi z HRP kozimi anty-króliczymi surowicami odpornościowymi, a następnie leczono w celu zwiększenia chemiluminescencji (NEN Life Science Products Inc., Boston, Massachusetts , USA). Wyniki Poziomy mRNA Pdx1 mierzono za pomocą RT-PCR w ekstraktach z wysepek młodych samców myszy. W porównaniu z poziomami dzikimi, poziomy mRNA Pdx1 były zmniejszone w Irs2a / r. wysepki (Figura 1a); podobne wyniki uzyskano z dopasowaną wiekiem kobietą Irs2. /. myszy (dane nie pokazane). Hnf3. (znany również jako Foxa2) został również zredukowany w wysepkach z Irs2. /. myszy, podczas gdy poziomy Hnf1 ., Hnf1. i Hnf4. były w przybliżeniu normalne u samca Irs2. /. myszy (Figura 1a). Immunoblotting potwierdził, że poziom białka Pdx1 był niski u mężczyzn i kobiet, Irs2a / r. wysepki (Figura 1b). Przeciwnie, poziomy mRNA dla Pdx1 i różnych czynników jądrowych hepatocytów były prawie normalne w Irslp. wysepki w wieku 6 tygodni, a badanie immunoblotowe potwierdziło, że białko Pdx1 było normalne u samic Irsl. /. myszy (Figura 1b). Specyficzna redukcja ekspresji Pdx1 w Irs2. /. myszy mogą być szczególnie ważne dla progresji do cukrzycy, ponieważ Pdx1 reguluje składniki szlaku wykrywającego glukozę, a procesy patologiczne, które zmniejszają ekspresję Pdx1, powodują nietolerancję glukozy (11, 15). Figura Ekspresja czynników jądrowych hepatocytów (HNF) i Pdx1 w wysepkach trzustkowych. (a) TaqMan RT-PCR Hnf1a, Hnf1a, Hnf3a, Hnf4a i Pdx1 w wysepkach z typu dzikiego (WT) (n = 4), Irslp. (n = 2) i Irs2. /. (n = 5) samców myszy w wieku 6 tygodni. Dane są normalizowane względem ekspresji genów cyklofilowych i wyrażone jako średnie. SEM. (b) Western blot Pdx1 w wysepkach myszy samców (na górze) i samic (na dole). Aby przetestować rolę Pdx1 w Irs2. /. myszy, mamy skrzyżowane Irs2 + /. myszy z Pdx1 + /. myszy i krzyżowane wstecznie złożone heterozygoty w celu wytworzenia dziewięciu oczekiwanych genotypów na częstotliwościach mendlowych (8). W P2.5, haploinsufficiency dla Pdx1 lub Irs2 nie miało wpływu na masę ciała, podczas gdy Irs2. /. myszy były nieco mniejsze w porównaniu z żywymi miotami (Figura 2a). Irs2. /. Pdx1 + /. myszy i myszy pozbawione Pdx1 (Pdxl