Dla każdej próbki, porównano trzykrotne wartości ekspresji genów z krzywymi standardowego rozcieńczenia cDNA dla wysepek typu dzikiego rozcieńczeń log4 (nierozcieńczonych, 1: 4, 1:16, 1:64) przeprowadzonych w trzech powtórzeniach (cykl progowy Pdx1 (Ct) = 23, r2 = 0,99, Hnf1aCt = 28, r2 = 0,96, Hnf1aCt = 29, r2 = 0,88, Hnf3aCt = 27, r2 = 0,95, Hnf4aCt = 29, r2 = 0,99, cyklofilina Ct = 21, r2 = 0,98). Względne ilości produktu genu podano jako średnie. SEM kilku zwierząt dla każdego genu w porównaniu z cyklofiliną (typu dzikiego, n = 4, Irs1a / a, n = 2, Irs2a / a, n = 5). W analizie Western blot lizaty wysepek białkowych SDS wyrównano pod względem obciążenia za pomocą całkowitego oznaczenia białka (Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois, USA) prowadzonego na 12% SDS-PAGE, przeniesiono na membranę nitrocelulozową Protan (Schleicher & Schuell Inc., Keene, New Hampshire, USA), inkubowano z króliczymi anty-N-końcowymi surowicami odpornościowymi Pdx1 (z CVE Wright) i skoniugowanymi z HRP kozimi anty-króliczymi surowicami odpornościowymi, a następnie leczono w celu zwiększenia chemiluminescencji (NEN Life Science Products Inc., Boston, Massachusetts , USA). Wyniki Poziomy mRNA Pdx1 mierzono za pomocą RT-PCR w ekstraktach z wysepek młodych samców myszy. W porównaniu z poziomami dzikimi, poziomy mRNA Pdx1 były zmniejszone w Irs2a / r. wysepki (Figura 1a); podobne wyniki uzyskano z dopasowaną wiekiem kobietą Irs2. /. myszy (dane nie pokazane). Hnf3. (znany również jako Foxa2) został również zredukowany w wysepkach z Irs2. /. myszy, podczas gdy poziomy Hnf1 ., Hnf1. i Hnf4. były w przybliżeniu normalne u samca Irs2. /. myszy (Figura 1a). Immunoblotting potwierdził, że poziom białka Pdx1 był niski u mężczyzn i kobiet, Irs2a / r. wysepki (Figura 1b). Przeciwnie, poziomy mRNA dla Pdx1 i różnych czynników jądrowych hepatocytów były prawie normalne w Irslp. wysepki w wieku 6 tygodni, a badanie immunoblotowe potwierdziło, że białko Pdx1 było normalne u samic Irsl. /. myszy (Figura 1b). Specyficzna redukcja ekspresji Pdx1 w Irs2. /. myszy mogą być szczególnie ważne dla progresji do cukrzycy, ponieważ Pdx1 reguluje składniki szlaku wykrywającego glukozę, a procesy patologiczne, które zmniejszają ekspresję Pdx1, powodują nietolerancję glukozy (11, 15). Figura Ekspresja czynników jądrowych hepatocytów (HNF) i Pdx1 w wysepkach trzustkowych. (a) TaqMan RT-PCR Hnf1a, Hnf1a, Hnf3a, Hnf4a i Pdx1 w wysepkach z typu dzikiego (WT) (n = 4), Irslp. (n = 2) i Irs2. /. (n = 5) samców myszy w wieku 6 tygodni. Dane są normalizowane względem ekspresji genów cyklofilowych i wyrażone jako średnie. SEM. (b) Western blot Pdx1 w wysepkach myszy samców (na górze) i samic (na dole). Aby przetestować rolę Pdx1 w Irs2. /. myszy, mamy skrzyżowane Irs2 + /. myszy z Pdx1 + /. myszy i krzyżowane wstecznie złożone heterozygoty w celu wytworzenia dziewięciu oczekiwanych genotypów na częstotliwościach mendlowych (8). W P2.5, haploinsufficiency dla Pdx1 lub Irs2 nie miało wpływu na masę ciała, podczas gdy Irs2. /. myszy były nieco mniejsze w porównaniu z żywymi miotami (Figura 2a). Irs2. /. Pdx1 + /. myszy i myszy pozbawione Pdx1 (Pdxl P, Irs2 + / Pdxl2 / P, lub Irs2 P / P Pxl2 / P) były o około 40% mniejsze przy P2.5 i nie uzyskały później masy (Figura 2a i dane nie pokazane). W ciągu pierwszych 5 dni po urodzeniu większość myszy wykazywała prawidłowy poziom glukozy we krwi, w tym Irs2. /. i Pdx1. /. myszy (Figura 2b). Jednak Irs2. /. Pdx1 + /. u myszy rozwinęła się ciężka hiperglikemia i zmarła na P4; Irs2. /. Pdx1. /. myszy wykazały podobny wynik (Figura 2c i dane niepokazane). W Irs2. /. Pdx1 + / nie zaobserwowano dymorfizmu płciowego. fenotypy myszy, jako męskie (n = 5) i żeńskie (n = 10) Irs2a / Pdxl + / r. młode rozwinęły hiperglikemię i zmarły na P4. Natomiast Pdx1. /. myszy wykazywały prawidłowy poziom glukozy we krwi przy P2.5 i przeżywały do 9 dni, co sugeruje, że sygnalizacja Irs2 może promować homeostazę glukozy u noworodków bez insuliny (Figura 2b). Jak pokazano wcześniej, Irs2. /. u myszy rozwinęła się hiperglikemia na czczo po 8 tygodniach i zmarła pomiędzy 12 a 15 tygodniem życia (2, 7). Figura 2 Charakterystyka potomstwa potomka Irs2 + / P Pdx1 + /. intercross. (a) Masy ciała Irs2 + /. Pdx1 + /. między młodymi szczeniętami mierzonymi na P2.5. Wyniki są podane jako średnie. SEM co najmniej siedmiu myszy (z wyjątkiem myszy Irs2a / Pdxl (3 / n, n = 3). ** P <0,01 w porównaniu z wszystkimi innymi genotypami. (b) Glukoza we krwi Irs2 + / Pdxl + /. między młodymi szczeniętami mierzonymi na P2.5. Wyniki są podane jako średnie. SEM co najmniej siedmiu myszy lub trzech Irs2a / Pdxl. /. myszy. ** P <0,01 dla Irs2a / Pdxl + /. lub Irs2. /. Pdx1. /. myszy w porównaniu z wszystkimi innymi genotypami. (c) Wartości glukozy we krwi typu dzikiego, Irs2a / p, Pdxl + / a, i Irs2a / Pdxl + / r. szczenięta myszy w pierwszych 4 dniach życia. Wyniki są podane jako średnie. SEM co najmniej siedmiu myszy. Skrawki trzustki wybarwiono immunologicznie przeciwciałami przeciw insulinie i glukagonem, aby scharakteryzować histologię wysepek i oszacować obecność trzustki. zawartość komórki [hasła pokrewne: carcinoma adenoides cysticum, gorvita zielony jęczmień opinie, bartnik pl ] [patrz też: bartnik bielsko, przychodnia bielsko komorowicka, ostry dyzur okulistyczny ]