Receptor wykrywający wapń jest wymagany do prawidłowej homeostazy wapnia, niezależnie od hormonu przytarczyc ad

Tutaj opisujemy wyniki naszych wysiłków zmierzających do oddzielenia bezpośredniego efektu niedoboru CaR od zakłócających efektów nadczynności przytarczyc i hiperkalcemii poprzez zbadanie roli CaR w mysim modelu pozbawionym PTH. Homozygotyczne myszy z niedoborem PTH (Ptha / a) wykazują zmniejszoną mineralizację macierzy chrząstki i zmniejszone osteoblasty metafizyczne i kości beleczkowate w okresie płodowym i noworodkowym, ale te wyniki normalizują się w wieku dorosłym (28). Wyhodowaliśmy CaR + /. myszy myszy heterozygotycznych pod względem zerowego allelu Pth (Pth + / a) i krzyżowały potomstwo podwójnie heterozygotyczne, aby wytworzyć myszy pozbawione zarówno PTH, jak i CaR (Ptha / P CaR2 / P). Dokonaliśmy bezpośrednich porównań między fenotypami CaR. /. myszy i współżyjące z płcią mioty z mojego rodzeństwa, na Pth. /. tła w celu oceny roli CaR niezależnie od wpływu PTH. Metody Wyprowadzanie myszy podwójnie pustych PTH i CaR. Pochodzenie dwóch rodzicielskich szczepów CaRa /. myszy i Pth. /. myszy przez homologiczną rekombinację w embrionalnych komórkach macierzystych opisano wcześniej w Ho i wsp. (13) i Miao i in. (28). Pokrótce, gen oporności na neomycynę wprowadzono do eksonu 5 mysiego genu CaR. Analiza Western błot ekstraktów błony komórkowej nerki z homozygotycznego CaRa /. myszy potwierdziły, że nie wykryto żadnego wykrywalnego białka z tego allelu (13). Gen oporności na neomycynę wprowadzono do egzonu 3 mysiego genu Pth, co spowodowało zastąpienie całej sekwencji kodującej dojrzałego PTH. Brak ekspresji PTH w gruczołach przytarczyc został potwierdzony przez immunobarwienie (28). Myszy heterozygotyczne pod względem zerowego allelu CaR zostały wcześniej opisane jako płodne (13), podobnie jak myszy heterozygotyczne względem zerowego allelu Pth (28). CaR + /. myszy były łączone z Pth + /. myszy. Potomstwo heterozygotyczne w obu loci były następnie łączone ze sobą w celu uzyskania szczeniąt homozygotycznych pod względem zarówno alleli PTH i CaR zerowych (Ptha / P CaRs / P). Linie utrzymywano przez hodowlę Pth. /. CaR. /. mężczyźni na Pth + / yCaR + /. kobiety. Te myszy utrzymywano na mieszanym podłożu genetycznym z udziałem szczepów C57B6, 129 / SvJ i 129 / SvEv. Eksperymenty in vivo. Protokoły dla zwierząt zostały zatwierdzone przez instytucjonalny komitet ds. Opieki nad zwierzętami i użytkowania w Harvard Medical School i były zgodne z wytycznymi NIH dla opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych. Myszy trzymano w klatkach do mikronizatora w obiekcie wolnym od patogenów zgodnie z przepisami Harvard Medical School Centre for Animal Resources. Woda była podawana ad libitum. W celu uniknięcia hipokalcemii wywołanej niedoborami przytarczyc spowodowanej maskowaniem jakichkolwiek efektów funkcjonalnych zerowych alleli CaR, wszystkie zwierzęta homozygotyczne pod względem alleli PTH bez żadnego, niezależnie od genotypu CaR, były karmione dietą wysokobłonową (2% wapnia, 0,4% fosforanu, 6000 U witamina D, Harlan Teklad-TD99224, Harlan-Teklad, Madison, Wisconsin, USA). Genotypowanie myszy. Genomowy DNA wyizolowano z fragmentów ogonka za pomocą standardowej ekstrakcji fenol-chloroform i strącania izopropanolu. W celu określenia genotypu zarówno w loci Pth, jak i CaR, cztery reakcje amplifikacji PCR były wymagane dla każdego zwierzęcia. W celu oznaczenia obecności allelu CaR typu dzikiego, próbki amplifikowano za pomocą startera CaR CaR6h5. (5. TCT GTT CTC TTT AGG TCC TGA AAC A 3.) I CaR6h3 odwrotnego primera CaR. (5. TCA TTG ATG AAC AGT CTT TCT CCC T3.). Aby wykryć obecność zerowego allelu CaR, zastosowano primer przedni Neo r-Neo-2 (5. TCT TGA TTC CCA CTT TGT GGT TCT A 3.) Z CaR6h3. Odwrotnym primerem CaR. Allel Pth typu dzikiego wykrywano za pomocą startera PTH PTHF2 (5. GAT GTC TGC AAA CAC CGT GGC TAA 3.) I PTHR2 odwrotnego PTH (5. TCC AAA GTT TCA TAG TAG Aag 3.). Allel zerowy Pth oznaczano przy użyciu startera Neo do przodu r-Neo-2 i startera PTH PTH PTH. Wszystkie reakcje PCR przeprowadzono przy użyciu Hot Taq polimerazy (Qiagen, Valencia, Kalifornia, USA) z 35 cyklami 95 ° C przez 17 minut, 94 ° C przez 30 sekund, 55 ° C przez 30 sekund i 72 ° C przez 45 sekund, a następnie końcowe 7-minutowe rozszerzenie w temperaturze 72 ° C. Histopatologia. Podczas sekcji, myszy perfundowano w utrwalaczu Bouina przez kilka dni w temperaturze otoczenia. Nerki, jelita, mózg, kręgosłup, serce, płuca i tkanki kostne zostały wycięte i osadzone w wosku parafinowym. Tarczycę, gruczoły przytarczyczne, tchawicę, przełyk, mięśnie i tkankę tłuszczową wycinano, przetwarzano i włączano en bloc. Wszystkie sekcje były poplamione H & E. Aby zlokalizować przytarczyce, seryjne odcinki bloku tarczycy zostały pocięte na grubość 5 .m. Procedury analityczne do określania parametrów surowicy i moczu. Na jeden dzień przed uśmierceniem myszy trzymano w klatkach metabolicznych, a mocz zbierano przez 16 godzin przez noc
[przypisy: klinika stomatologiczna łódź, centrum pszczelarskie łysoń, podchloryn sodu dawkowanie ]
[patrz też: bartnik pl, sprzęt pszczelarski łysoń, centrum pszczelarskie łysoń ]