Receptor wykrywający wapń jest wymagany do prawidłowej homeostazy wapnia, niezależnie od hormonu przytarczyc cd

Myszy uśmiercono przy użyciu CO2, a krew zebrano przez nakłucie serca. Stężenie wapnia w surowicy i moczu oznaczano metodą o-kresoloftaleiny-kompleksonu (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA). Stężenia kreatyniny w surowicy i moczu mierzono za pomocą metody alkalicznego pikrydu (Sigma-Aldrich). Stężenie fosforu w surowicy i moczu oznaczano metodą molibdenianową amonu (Sigma-Aldrich). Wydzielanie frakcyjne wapnia obliczono zgodnie z następującym równaniem: FECa = (stężenie wapnia w kreatyninie w moczu) / (stężenie kreatyniny w osoczu Ca x) × 100. Izolacja RNA i wytwarzanie cDNA. Całą nerkę i dwunastnicę wycięto, zamrożono w ciekłym azocie i przechowywano w temperaturze ~ 80 ° C aż do użycia. Próbki tkanek rozmrożono w odczynniku TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornia, USA) i homogenizowano. Ekstrakcję RNA przeprowadzono zgodnie z protokołem producenta TRIzol. Reakcje odwrotnej transkrypcji przeprowadzono przy użyciu SuperScript, systemu syntezy pierwszej nici (Invitrogen). Wykrywanie ekspresji CaT1 i CaT2 / ECaC transportera wapnia przez ilościową PCR w czasie rzeczywistym. W celu określenia liczby cząsteczek cDNA w próbkach odwrotnej transkrypcji przeprowadzono analizy PCR w czasie rzeczywistym przy użyciu systemu LightCycler (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, Indiana, USA). PCR przeprowadzono przy użyciu 2 .l głównego DNA LightCycler SYBR Green I (Roche), 0,25 .M każdego 5 .l. i 3. primer i 2. l próbek lub H2O do końcowej objętości 20. l. Stężenie MgCl2 doprowadzono do 3 mM. Próbki denaturowano w 95 ° C przez 20 sekund przy tempie przejścia temperatury 20 ° C na sekundę. Amplifikację i oznaczanie fluorescencji przeprowadzono w czterech etapach: denaturację w 95 ° C przez 0 sekund, z szybkością przejścia temperatury 20 ° C na sekundę; wygrzewanie przez 5 sekund w 62 ° C dla transportera wapnia typu (CaT1) i transportera wapnia typu 2 (CaT2 / ECaC) i w 60 ° C dla GAPDH, z tempem przejścia temperatury 8 ° C na sekundę; wydłużanie w 72 ° C przez 20 sekund (25 sekund dla GAPDH), z tempem przejścia temperatury 4 ° C na sekundę; i detekcja fluorescencji SYBR Green, która odzwierciedla ilość dwuniciowego DNA i została przeprowadzona w 86 ° C (85 ° C dla GAPDH) przez 3 sekundy. Liczba cykli amplifikacji wynosiła 40 dla CaT1 i CaT2 / ECaC i 30 dla GAPDH. W celu rozróżnienia specyficznych produktów niespecyficznych cDNA, uzyskano krzywą topnienia pod koniec każdego przebiegu. Produkty denaturowano w 95 ° C przez 3 sekundy, a następnie temperaturę obniżono do 65 ° C przez 15 sekund i powoli podnoszono z 65 ° C do 95 ° C stosując szybkość przejścia temperatury 0,1 ° C na sekundę. Aby określić liczbę kopii docelowego DNA w próbkach, oczyszczone fragmenty PCR o znanych stężeniach były seryjnie rozcieńczane i służyły jako wzorce zewnętrzne, które zmierzono w każdym doświadczeniu. Dane znormalizowano poziomami GAPDH w próbkach. Sekwencje starterów stosowane do PCR są następujące: Starter przedni CaT1, (5 (3 ATC GAT GGC CCT GCG AAC T3 (3); Odwrotny primer CaT1, (5. AGAG AGT AGA GGC CAT CTT GTT GCT G 3.); Start przedni CaT2, (5. ATT GAC GGA CCT GCC AAT TAC AGA G 3.); Odwrotny primer CaT2, (5. GTG TTC AAC CCG TAA GAA CCA ACG GTC 3.); GAPDH przedni starter, (5. TCA CCA TCT TCC AGG AGC G3.); i starter odwrotny GAPDH, (5-CTG CTT CAC CAC CTT CTT GA 3.). Przygotowanie próbek do badania gęstości mineralnej kości i analizy histomorfometrycznej. Obie tylne kończyny wypreparowano ze szkieletu osiowego i usunięto z otaczającej tkanki, a następnie zanurzono w 70% etanolu w kolumnie kręgowej w celu utrwalenia. Ponadto trzy pary myszy znakowano podwójnymi fluorochromami do dynamicznego badania histomorfometrycznego kości. Chlorowodorek tetracykliny (0,03 mg / g masy ciała) podawano dootrzewnowo 10 dni przed uśmierceniem. Kalceinę (0,02 mg / g masy ciała) podawano dootrzewnowo 3 dni przed uśmierceniem. Pomiar gęstości mineralnej kości. Pomiary gęstości mineralnej kości (BMD) przeprowadzono na wypreparowanych kościach za pomocą księżycowej densytometrii PIXImus (GE Lunar Corporation, Madison, Wisconsin, USA). Pomiary przeprowadzono na prawej kości udowej i piszczelowej, lewej kości udowej i kości piszczelowej oraz kręgosłupa lędźwiowego za pomocą oprogramowania do analizy obrazu dostarczonego przez system. BMD (wg / cm2) określono jako całkowitą masę minerału kostnego na jednostkę rzutowanych obszarów. Histomorfometria kości. Po utrwaleniu w 70% etanolu przez 48 godzin i akwizycji obrazu BMD, niedomowe lewe kończyny tylne i górny kręgosłup (kręgi piersiowe) zostały osadzone w metakrylanie metylu dla dynamicznych badań kości. Prawa tylne kończyny i dolny kręgosłup (obszary lędźwiowe i krzyżowe) zostały odwapnione, przetworzone i zatopione w parafinie pod kątem H & E i odpornego na działanie kwasu ftalaty kwasu fosfatazy (TRAP)
[więcej w: łysoń sklep, bartnik bielsko, sklep łysoń ]
[więcej w: sklep pszczelarski łysoń, bartnik bielsko, przychodnia bielsko komorowicka ]