Rola mediatora wnikania wirusa opryszczki jako negatywnego regulatora odpowiedzi pośredniczonych przez limfocyty T ad 6

Dlatego HVEM może odgrywać podwójną rolę w aktywacji limfocytów T i homeostazie, w zależności od ligandu i zaangażowania receptora podczas odpowiedzi immunologicznych. Interesujące będzie ustalenie, w jaki sposób HVEM może odbierać i dostarczać różne sygnały w przyszłości. Metody Myszy. Myszy C57BL / 6 zakupiono w The Jackson Laboratory. Myszy utrzymywano w określonych warunkach wolnych od patogenów. Opieka nad zwierzętami i ich stosowanie były zgodne z protokołami i wytycznymi instytucjonalnymi i NIH, a wszystkie badania zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Pielęgnacji i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu w Chicago. ŚWIATŁO./. myszy zostały dostarczone przez Lieping Chen (Johns Hopkins University, Baltimore, Maryland, USA) (13-15). Wytwarzanie myszy z niedoborem HVEM. Klon genomowego sztucznego chromosomu bakteryjnego (BAC) zawierający locus HVEM uzyskano z Genome Systems Inc. przez przeszukiwanie biblioteki BAC ze starterami specyficznymi dla HVEM, pochodzącymi z sekwencji mRNA HVEM (muHVEM2: 5a-ATGGCCTGAGCAAGTGTCTGC-3y; Int3Rev: 5a-ACACACCCTGAGAACCTGCCCAC-3.). Podklon genomowy o wielkości około 8,8 kb (z miejscami restrykcyjnymi HindIII) kodujący HVEM subklonowano i całkowicie sekwencjonowano. Wektor celujący skonstruowano przy użyciu homologicznych fragmentów locus HVEM (patrz Figura 1). Egz. 2 i 3 oraz 5. region eksonu 4 zastąpiono kasetą pułapki genowej intronu obejmującą sekwencję akceptorową 2 karbowanego splicingu, kasetę a-gal i kasetę oporności na gen neomycynę. Do selekcji negatywnej wprowadzono wirusową kasetę kinazy tymidynowej do wektora kierującego. Celowanie genowe w komórkach ES z E14.1 przeprowadzono jak opisano wcześniej (35). Badania przesiewowe pod kątem rekombinowanych linii komórek ES wykonano metodą PCR przy użyciu starterów HVEM-SP-5. (5a -TCCCTGAGGCTGAGAGGTTCC-3.) I pJak2 (5a -CTGAAGAGGAGTTTACGTCCAG-3.). Dwa z 723 komórek G418 opornych na ES dały pozytywne sygnały do rekombinacji homologicznej i można je było zweryfikować za pomocą analizy Southern blot (trawienie EcoRI) przy użyciu 5. sonda flankująca. Pojedynczą integrację wektora docelowego sprawdzono metodą Southern blot przy użyciu sondy neomycynowej (trawienie NheI); tutaj tylko pas hybrydyzujący był wykrywalny (dane nie pokazane). Oba klony komórek ES zawierające prawidłowo ukierunkowany allel HVEM wstrzyknięto do blastocyst C57BL / 6. Przeniesienie zarodka inaktywowanego locus HVEM obu linii komórkowych zostało potwierdzone za pomocą PCR i analizy Southern blot. Myszy heterozygotyczne krzyżowano wstecznie 5-krotnie ze szczepem C57BL / 6. W generacji N7 homozygotyczne potomstwo uzyskano przez krzyżowanie krzyżowe z HVEM + /. myszy. Genotypowanie dla alleli HVEM przeprowadzono za pomocą PCR stosując startery HVEM-SP-5. i pJak2 dla inaktywowanego allelu i starterów HVEM-SP-5. i HVEM-SP-3a-WT (5a-AAGAGGCAGCAGGGTCAGCTGG-3a) dla allelu WT. Myszy trzymano w specjalnym obiekcie wolnym od patogenów. W celu weryfikacji inaktywacji genu HVEM przeprowadzono analizę Northern blot RNA śledziony przy użyciu cDNA obejmującego zewnątrzkomórkową domenę mysiego HVEM. Generowanie przeciwciała anty-HVEM. Szczury immunizowano 2-krotnie 100. G białka fuzyjnego HVEM . mysiej Ig zmieszanego z kompletnym adiuwantem, a następnie wzmacniano 100. G rozpuszczalnego HVEM-Ig 3 dni przed fuzją. Po fuzji, 56 klonów wiążących się z HVEM-Ig wybrano za pomocą ELISA i, z których 2, które swoiście wiążą się z HVEM, ale nie z mysimi Ig, dalej scharakteryzowano jako IgM z a. łańcuch. Wiążą się z komórkami dodatnimi pod względem HVEM, ale nie z komórkami negatywnymi względem HVEM. Generowanie rekombinowanego LIGHT ze zmodyfikowaną domeną zewnątrzkomórkową. Zewnątrzkomórkowy fragment mysiego LIGHT (85-240 aminokwasów) zamplifikowano za pomocą PCR i wstawiono do wektora flagowego Pcmv-flag (Sigma-Aldrich) w Hindlll / BamHI w ramce ze znacznikiem flagowym (Pcmv-flag-LIGHT). Pcmv-flag-LIGHT użyto jako szablonu do amplifikacji fragmentu flag-LIGHT, który następnie wstawiono do ssaczego wektora ekspresyjnego pEf-Bos (dostarczonego przez WM Yokoyama, Washington University, St. Louis, Missouri, USA). Linie komórkowe CHO kotransfekowano pEf-Bos-flag-LIGHT i pcDNA3.1-hygromycin za pomocą odczynnika Lipofectamine (Invitrogen Corp.). Transfektanty zostały wybrane przez 500 .g / ml higromycyny. Flag-LIGHT oczyszczono z supernatantu hodowli anty-flagowym żelem powinowactwa M2-agaroza. Leczenie ConA. ConA (Sigma-Aldrich) podawano iv myszom w różnych dawkach, jak wskazano. Surowice zebrano we wskazanych czasach dla pomiaru cytokin i enzymów wątrobowych. Aktywność AST i ALT w osoczu określono przy użyciu Reflotron Plus zgodnie z procedurą producenta (Roche Diagnostics Corp.). Histopatologia i barwienie TUNEL. Śledzionę i tkanki wątroby utrwalono w 10% roztworze formaliny, a następnie zatopiono w parafinie
[więcej w: centrum pszczelarskie łysoń, wieniec zdrój sanatorium hutnik, sklep łysoń ]
[podobne: klinika stomatologiczna łódź, carcinoma adenoides cysticum, operacje plastyczne dr szczyt ]