Rola mediatora wnikania wirusa opryszczki jako negatywnego regulatora odpowiedzi pośredniczonych przez limfocyty T ad 7

Barwienie H & E na skrawkach tkanek zamkniętych przeprowadzono zgodnie ze standardową procedurą. Komórki przechodzące apoptozę wykryto przy użyciu zmodyfikowanej metody TUNEL w ośrodku immunohistochemicznym na Uniwersytecie w Chicago. Pokrótce, sekcje śledziony inkubowano z 2 mM sprzężonym z digoksygeniną dUTP (Chemicon Inc.) i 5 U końcowej transferazy dezoksyrybonukleotydowej (TdT) w buforze TdT (0,5 M kakodylanu [pH 6,8], mM CaCl2, 0,5 mM DTT, 0,05 % BSA, 0,15 M NaCl). Po płukaniu w soli fizjologicznej buforowanej Tris sekcje inkubowano z przeciwciałem anty-owczym Ig sprzężonym z HRP (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.). Rozwój barwy dla związanego HRP był z 3-amino-9-etylokarbazolem (Sigma-Aldrich). Skrawki następnie barwiono kontrastowo. Proliferacja komórek T in vitro. Splenocyty (2 x 105 na studzienkę) od myszy C57BL / 6 i HVEM p / l. myszy hodowano w płaskodennych 96-studzienkowych płytkach z 0,3, 0,6, 1,2 i 2,4 ug / ml ConA lub anty-CD3 przez 48 godzin. Supernatanty zebrano po 48 godzinach dla pomiaru cytokin, a następnie hodowane komórki pulsowano 0,5 Ci 3H-tymidyny przez 16 godzin przed zbiorem. W niektórych doświadczeniach komórki T oczyszczone perełkami MACS (Miltenyi Biotec) hodowano w ilości 1×105 na studzienkę. W celu stymulacji antygenem komórki DLN izolowano 10 dni po immunizacji i hodowano w płaskodennych 96-studzienkowych płytkach w stężeniu 5 x 105 komórek na dołek przy różnych stężeniach peptydów MOG. Płytki pulsowano 3H-tymidyną (Amersham Pharmacia Biotech) w stężeniu 0,5. Ci / studzienkę w dniu 2 (dla anty-CD3) lub dniu 4 (dla peptydu) hodowli przez ostatnie 18 godzin. Inkorporację tymidyny do DNA zmierzono za pomocą zliczania scyntylacyjnego cieczy, a średnią obliczono z 3 dołków. Analiza cytometrii przepływowej. Zawiesiny jedno-komórkowe splenocytów i tymocytów zebrano i wybarwiono przeciwciałami: PE3 anty-CD8, CyChrome . anty-CD4, FITCy anty-CD69, CyChrome . anty-CD44, PE3 anty-B220 i PE3 anty-CD3. (BD) i znakowane biotyną mAb anty-HVEM w PBS plus 0,01% NaN3 przez 30 minut w 4 ° C. W przypadku przeciwciał znakowanych biotyną, jako przeciwciało drugorzędowe zastosowano streptawidynę-CyChrome (BD). Po inkubacji z przeciwciałami komórki przemywano i analizowano na FACScan (BD). Pomiar cytokin. Test kulek cytokinowych (BD Biosciences. Pharmingen) lub kanapkowy test ELISA (BD Biosciences. Pharmingen) zastosowano do testowania poziomu cytokin supernatantów hodowli lub surowic zgodnie z instrukcjami producenta. Indukcja EAE. W celu indukcji EAE przez aktywną immunizację, samice myszy C57BL / 6 i HVEMa /. myszy immunizowano sc w 4 miejscach na boku w dniach 0 i 7 w sumie 100 .g peptydu MOG35 (3 zemulgowanego w równej objętości CFA (GIBCO; Invitrogen Corp.) zawierającego .g / ml Mycobacterium tuberculosis H37 RA (Difco Laboratories). Peptyd MOG353 (MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK) zsyntetyzowano w Alpha Diagnostic International Inc. Peptydy miały czystość ponad 86%, jak określono metodą HPLC. Myszy otrzymały również zastrzyki iv 200 ng toksyny krztuścowej (List Biological Laboratories Inc.) w dniu 0 z peptydem. Myszy oceniano codziennie pod kątem objawów EAE zgodnie z następującym klinicznym systemem oceny: 0, brak objawów klinicznych; 0,5, częściowa utrata toniczności ogonowej; 1, całkowita utrata toniczności ogonowej; 2, zwiotczały ogon i nieprawidłowy chód; 3, porażenie kończyn tylnych; 4, porażenie kończyn tylnych z niedowładem tylnego ciała; 5, porażenie kończyn tylnych i kończyn przednich; 6, śmierć. Wykrywanie IFN-y wytwarzanie komórek przez ELISPOT. Seryjne 5-krotne rozcieńczenia komórek DLN wysiewano w trzech powtórzeniach na 96-studzienkowe płytki (zestaw ELISPOT, BD) w obecności 25 ug / ml MOG i inkubowano przez noc w 37 ° C. Związany IFN-y wykrywano przez inkubację ze skoniugowanym z fosfatazą alkaliczną kozim anty-mysim IFN-y. (BD) w temperaturze pokojowej przez 3 godziny. Tworzenie koloru przeprowadzono za pomocą roztworu substratu tetrazoliowego nitroblue (BD). Podziękowania Badania te uzyskały granty NIH (R01 HD37104, R01 DK58897 i P01 CA09296-01) oraz Deutsche Forschungsgemeinschaft (Pf 259 / 2-6 i Sonderforschungsbereiche 575, 576). Dziękujemy firmie Carl Ware za pomocną dyskusję. Przypisy Niestandardowe skróty: ALT, aminotransferaza alaninowa; AST, aminotransferaza asparaginianowa; Tłumik limfocytów BTLA, B i T; ConA, concanavalin A; DLN, drenujący węzeł chłonny; EAE, eksperymentalna autoimmunologiczna encefalopatia; HVEM, mediator wejścia herpeswirusa. Konflikt interesów: Autorzy zadeklarowali brak konfliktu interesów.
[przypisy: przeszczep szpiku kostnego, carcinoma adenoides cysticum, ostry dyzur okulistyczny ]
[przypisy: finasteryd skutki uboczne, dom latających sztyletów cda, depilacja brazylijska poznań ]