Rola mediatora wnikania wirusa opryszczki jako negatywnego regulatora odpowiedzi pośredniczonych przez limfocyty T ad

Oczekiwany rozmiar fragmentu po hybrydyzacji z 5. sonda flankująca (trawienie EcoRI genomowego DNA) wynosi około 17 kb dla allelu WT i 10 kb dla inaktywowanego allelu. EN-2, miejsce zaakceptowania sklejanego 2 spawów; lacZ, a-ekspresyjna kaseta ekspresyjna; pA, sygnał poliadenylacji; DSE, dalszy element; neo, kaseta genowa oporności na neomycynę; HSV-TK, kaseta ekspresyjna kinazy tymidynowej herpeswirusa. (B) Analiza typu Southerna myszy po przeniesieniu mutacji HVEM linii zarodkowej. Pokazano hybrydyzację strawionego EcoRI DNA przedstawiciela myszy (E14, kontrolny DNA z komórek E14.1 ES). (C) Analiza Northern blot mRNA HVEM. Hybrydyzację RNA śledziony przedstawiono za pomocą mysiego cDNA HVEM obejmującego kompletną sekwencję kodującą zewnątrzkomórkową domenę. (D) Krew pobierano z C57BL / 6 (WT) i HVEMa /. myszy i białe krwinki barwiono znakowanym biotyną szczurzym przeciwciałem anty-HVEM i streptawidyną-CyChrome. (E) Komórki węzłów chłonnych z WT i HVEM . /. myszy barwiono przeciwciałem PE. anty-CD3, szczurzym przeciwciałem anty-HVEM znakowanym biotyną i streptawidyną-CyChrome. Ulepszona aktywacja HVEM. /. Komórki T in vitro i in vivo. Chociaż kilka badań sugerowało, że HVEM może mieć funkcję kostymulacyjną komórek T (5. 7), rola HVEM w aktywacji komórek T nigdy nie została bezpośrednio wykazana. W celu sprawdzenia, czy HVEM jest wymagany do aktywacji za pośrednictwem CD3, splenocyty izolowane z WT lub HVEM a /. myszy stymulowano mAb skierowanym przeciwko płytce CD3. Nieoczekiwanie, dane pokazały, że splenocyty z niedoborem HVEM reagowały na stymulację mAb anty-CD3 lepiej niż limfocyty śledziony WT (dane nie pokazane). Aby określić, czy niedobór HVEM ma bezpośredni wpływ na limfocyty T, oczyszczone limfocyty T (o czystości ponad 98%) zarówno z WT, jak i HVEMa /. myszy stymulowano unieruchomionym mAb anty-CD3. Komórki T z niedoborem HVEM wykazywały silniejszą odpowiedź proliferacyjną niż limfocyty T WT (Figura 2A), potwierdzając, że nadreaktywność obserwowana w limfocytach z niedoborem HVEM była wewnętrzna w populacji limfocytów T i może wystąpić w nieobecności APC. Wyniki te sugerują, że HVEM może odgrywać bezpośrednią negatywną rolę w modulowaniu aktywności komórek T. Figura 2 Nadreaktywne komórki T z niedoborem HVEM in vitro. (A) HVEM. /. Komórki T są bardziej wrażliwe na stymulację przez suboptymalne mAb anty-CD3, co wykazano w teście włączania 3H-tymidyny. Dane przedstawiają włączanie 3H-tymidyny w cpm. SD. Pokazano jedno z czterech niezależnych eksperymentów. (B) Splenocyty (2 x 105 na studzienkę) z WT i HVEMa /. myszy hodowano na 96-studzienkowych płytkach z 0, 0,3, 0,6 i 1,2 ug / ml ConA in vitro. HVEM. /. myszy wykazywały znacząco zwiększoną odpowiedź na ConA we wszystkich stężeniach (P <0,01). Dane reprezentują z 6 niezależnych eksperymentów. (C) Poziomy cytokin w supernatantach hodowli z B oznaczano za pomocą oznaczenia kulek cytokinowych. Komórki od HVEM. /. myszy wytwarzały również znacząco wyższe poziomy cytokin (P <0,001). Reprezentatywne dane przedstawiono w z 3 niezależnych eksperymentów. (D) Niedobór HVEM zarówno w komórkach T jak i APC przyczynia się do wyższych odpowiedzi limfocytów T na ConA. Komórki T od HVEM. /. myszy (T-KO) wykazywały wyższą proliferację niż komórki T od myszy WT w odpowiedzi na ConA, gdy dostarczono myszy APC z myszy WT (P <0,01) i APC z HVEM p / p myszy (APC-KO) zapewniały również lepszą stymulację niż APC od myszy WT (P <0,01), gdy komórki T z myszy WT użyto jako odpowiedzi. Reprezentatywne dane przedstawiono z 3 niezależnych doświadczeń. (E) Zwiększony HVEM. /. Odpowiedź komórek T, ale nie LIGHT. /. Odpowiedź komórek T na ConA in vitro. Splenocyty z WT HVEM . /. i lekki ./ . myszy zebrano i hodowano z ConA. Proliferację określono za pomocą oznaczenia włączania 3H-tymidyny (P <0,01), a poziomy cytokin oznaczono za pomocą testu kulek cytokinowych (P <0,05). Aby dokładniej zbadać odpowiedź HVEM. /. Komórki T do innych bodźców komórek T, splenocytów z WT i HVEMa /. myszy hodowano z różnymi dawkami konkanawaliny A (ConA). Konsekwentnie, HVEM. /. Komórki T wykazywały zwiększoną proliferację w porównaniu z komórkami T WT w odpowiedzi na ConA (Figura 2B). Ponadto, te komórki T wytwarzały wyższe poziomy cytokin w hodowli (Figura 2C). Aby określić, czy komórki T z niedoborem HVEM były bardziej aktywne, oczyszczone komórki T z WT i HVEM a /. myszy stymulowano ConA w obecności APC z niedoborem WT lub HVEM. Komórki T z niedoborem HVEM ponownie wykazały wyższą proliferację w odpowiedzi na stymulację ConA w porównaniu z komórkami T WT (Figura 2D) [więcej w: gorvita zielony jęczmień opinie, wrzodziejące zapalenie jelita grubego dieta, bartnik pl ] [hasła pokrewne: wrzodziejące zapalenie jelita grubego dieta, przeszczep szpiku kostnego, gorvita zielony jęczmień opinie ]