Sumoilated HSP90 jest dominującym czynnikiem dziedziczącym ryzyko dyssypcji komórek plazmatycznych ad 6

Pomimo faktu, że przenoszenie HSP90-SUMO1 stanowi bardzo silny czynnik ryzyka dla rozwoju MGUS / MM, ryzyko przewoźnika HSP90-SUMO1 w porównaniu z nośnikiem bez nośnika jest 14,8 wyższe dla Europejczyków, 6.2 dla Afroamerykanów i 7.4 dla japońskich zdrowych nośniki dla MGUS / MM / WM. Oznacza to, że tylko niewielu nosicieli rozwija się w postaci MGUS / MM / WM i może istnieć kilka pokoleń w rodowodzie, w których nie można znaleźć jawnego MGUS / MM / WM, pomimo faktu, że w każdym z nich znajduje się co najmniej jeden nośnik HSP90-SUMO1. generacja. W związku z tym ten dziedziczony czynnik ryzyka może zostać rozpoznany tylko wtedy, gdy do takich badań włączono więcej niż krewnych pierwszego stopnia pacjentów MGUS / MM z paraproteinami specyficznymi dla HSP90-SUMO1 . i więcej niż jedną lub dwie generacje. Nasze odkrycia nie tylko potwierdzają pogląd, że odziedziczone czynniki ryzyka odgrywają ważną rolę w patogenezie MGUS / MM / WM poprzez zapewnienie przewlekłej stymulacji antygenowej; powinny one również ułatwiać bardziej szczegółowe badania roli przewlekłej stymulacji antygenowej w tych chorobach i umożliwić badania asocjacyjne całego genomu w celu zidentyfikowania wariantu genetycznego odpowiedzialnego za specyficzny defekt desumoilacji HSP90-SUMO1 . w nośnikach HSP90-SUMO1. Metody Pacjenci i kontrole. Materiały od pacjentów i osób zdrowych uzyskano podczas rutynowych procedur diagnostycznych lub terapeutycznych i przechowywano w. 80 ° C. W przypadku zdrowych dawców powtórzenie elektroforezy w surowicy za pomocą immunofiksacji, jak również stosunku lekkiego łańcucha wykluczało obecność monoklonalnych Igs w surowicy tych osobników (dane nie przedstawione). Sumoilacja białek na membranach makromacierzy. Macierze białkowe o wysokiej gęstości Unipex i Unipex 2 otrzymano z Source Bioscience Life Sciences. W skrócie, każda membrana (Unipex lub Unipex 2) składa się z 15 300 łacińskich klonów ekspresyjnych UniPEx pochodzących z ludzkiego mózgu płodu, komórek T, płuc i okrężnicy, które po indukcji ekspresji reprezentują 7390 różnych rekombinowanych ludzkich białek (szczegóły, patrz http://www.lifesciences.sourcebioscience.com/products/antibodies/proteomics/protein-arrays/). Klony ekspresyjne pETE12 i pRHSUMO, funkcjonalne dla mechanizmu sumoilacji w E. coli, były dostarczone przez M. Mencía i V. de Lorenzo (24). Szczegółowo, 2 kultury E. coli maszyny sumoilacyjnej indukowano przez 4 godziny mM izopropylo-a-d-1-tiogalaktopiranozydem (IPTG), zanim komórki zebrano przez odwirowanie. Komórki poddawano lizie przez sonikację w ml 2 x PBS plus 1% Triton X-100, mM P-merkaptoetanol i mM PMSF. Każdy lizat odwirowano, a osad odrzucono. 2 ekstrakty zostały zmieszane 1: 2, aby uzyskać funkcjonalną mieszaninę sumoilacyjną (SUMOextract), która została użyta do sumoilacji białek związanych z błoną. Błony i kontrole Unipex (klony RanGAP dostarczone przez T. Sixma i K. Schwamborn, nr ref. 25) nakrapiane na PVDF inkubowano przez 30 minut w 37 ° C z rozcieńczonym SUMOextract 1: 5 w buforze reakcyjnym (50 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0,2 M DTT, 1% BSA, 3% Tween 20 i 5 mM ATP). Niespecyficznie związane białka następnie przemyto przy użyciu TBST, a następnie drugiego przemycia 1% SDS, 0,1%. -Merkaptoetanolu i 100 mM Na2PO4. Niespecyficzne wiązanie blokowano przez inkubację z 10% (w / v) beztłuszczowym mlekiem w proszku w TBST (TBS, 0,1% [v / v] Tween 20) w 4 ° C przez noc. Badanie przesiewowe sumoylowanych błon białkowych o dużej gęstości dla immunoreaktywności. Sumoilowane membrany zablokowano w 10% (w / v) beztłuszczowym mleku w proszku w TBST w temperaturze 4 ° C przez noc, przemyto dwukrotnie w TBST i inkubowano przez godzinę z surowicami zawierającymi paraproteiny rozcieńczonymi do x 106. Po późniejszej inkubacji z biotynylowane kozie przeciwludzkie IgA lub antyludzkie IgG, antyludzkie Fc, anty-ludzki łańcuch p-., anty-ludzki łańcuch lekki (1: 2500; Dako) i Strep-POX (1: 15 000) w 2% (w / v) mleko / TBST, filtry płukano w TBST, a następnie wykrywano stosując system ECL firmy Pharmacia (GE Health Care). Klony z pozytywnymi sygnałami otrzymano z Source Bioscience Life Sciences. Ogniskowanie izoelektryczne, Western blotting i koimmunoprecypitacja. Analizy przeprowadzono zgodnie z opisem (26). Zastosowano następujące przeciwciała: anty-HSP90 (1: 2000, przeciwciała-online), anty-SUMO (1: 1000, Biozol) i anty-SENP2 (1: 1000, przeciwciała-online). ELISA. ELISA przeprowadzono tak, jak opisano (26), z modyfikacją, że anty-HSP90 (przeciwciała-online) powlekano (4 ° C przez noc) na płytkach Nunc MaxiSorp (Nalge Nunc International) przed zablokowaniem płytek 1,5% żelatyną / PBS. Klonowanie i ekspresja BCR. Rozmazy szpiku kostnego od pacjentów z MM wykorzystano do izolacji genomowego DNA przy użyciu zestawu do oczyszczania DNA QIAGEN (QIAGEN)
[przypisy: gorvita zielony jęczmień opinie, podchloryn sodu dawkowanie, bartnik pl ]
[więcej w: płatki owsiane na wodzie, podchloryn sodu dawkowanie, wrzodziejące zapalenie jelita grubego dieta ]