Sumoilated HSP90 jest dominującym czynnikiem dziedziczącym ryzyko dyssypcji komórek plazmatycznych ad 7

Zmienne regiony ciężkich i lekkich łańcuchów Ig amplifikowano jak opisano wcześniej (27). Produkty PCR sekwencjonowano i adaptowano do wektora pCES w celu ekspresji białek znakowanych His6 w E. coli TG1, jak opisano wcześniej (2). Po lizie z PBS, produkty Fab oczyszczono metodą chromatografii powinowactwa z unieruchomionym jonem metalu (IMAC) (QIAGEN), zatężono i przechowywano w temperaturze ~ 20 ° C aż do użycia. Konkurs ELISA. Płytki Nunc MaxiSorp powlekano rekombinowanym HSP90-SUMO1, a następnie inkubowano z rekombinowanym znacznikiem His6 anty-HSP90-SUMO1 Fab. Zwiększanie ilości paraprotein oczyszczonych przez chromatografię białkową A / G od pacjentów. Dodano SERA w celu zastąpienia związanego Fab. Mutageneza ukierunkowana. Przy użyciu zestawu do mutagenezy ukierunkowanego miejsca QuikChange II (Agilent Technologies) i fragmentu DNA HSP90-SUMO1 (NM_007355.2) kodującego C-końcowe aminokwasy 155-724 znakowane FLAG, skonstruowano mutanty, w których lizyny zmieniono na argininy . Mutanty te stabilnie transfekowano do komórek HEK293. Fragmenty HSP90 amplifikowano przez PCR i HSP90 jako matrycę, a następnie klonowano do pSfi-FLAG jako wektor ekspresyjny. Wszystkie startery wymieniono w Suplementowych Metodach. shRNA knockdown białek SENP. Na potrzeby badania przesiewowego i późniejszych eksperymentów z knockdown, LCL transfekowano .g z 4 indywidualnych konstruktów shRNA SENP w pSUPER specyficznym dla knockdown specyficznego SENP. Użyte startery wymieniono w Supplemental Methods . Ekspresja SENP w LCL. ORF amplifikowano przez PCR stosując startery, które wprowadziły miejsce restrykcyjne EcoRV przed kodonem start i zastąpiły kodon stop innym miejscem EcoRV. Tępy koniec klonowania do miejsca EcoRV konstruktu subklonującego (pSfiExpress) dostarczył następnie C-końcowy znacznik FLAG i 2 flankujące miejsca SfiI do dalszego klonowania do konstruktów pRTS. Fragment SIII sklonowano następnie do miejsc SfiI pRTS (10, 11). Hodowla komórkowa i przejściowe transfekcje. LCL ustalono przez zakażenie PBMC EBV i hodowano jak opisano wcześniej (28). Transfekcje i analizy przeprowadzono zgodnie z opisem (26). Test komplementacji. PBMC transfekowano konstruktem eksprymującym HSP90-FLAG. Po 3 dniach hodowli komórki poddano lizie i inaktywowano (80 ° C, 15 minut). Drugą zdrową próbkę krwi użyto do przygotowania natywnych ekstraktów enzymatycznych (poddano lizie w 10 mM Tris pH 8 i odwirowano). Oba ekstrakty mieszano i inkubowano (37 ° C przez noc), a następnie analizowano metodą SDS-PAGE i immunodetekcję stosując mAb anty-FLAG. Test ekspresji i aktywności SENP2. SENP2 otrzymany z PBMC oczyszczono stosując unieruchomiony anty-SENP2 i użyto do inkubacji z GST-RanGAP-SUMO wytworzonym jak opisano powyżej. GST-RanGAP-SUMO1 (100 .M) inkubowano z SENP2 (50 .M) w 50 mM Tris-HCl pH 7,8 / 100 .g / ml BSA w 37 ° C przez 3 godziny. Reakcję zatrzymano przez dodanie buforu obciążającego żel i analizowano przez PAGE, a następnie immunodetekcję. Statystyka. Każdy eksperyment ELISA powtórzono co najmniej dwa razy. Dane przedstawione na rys. 3 reprezentują wartość średnią. SD z 3 niezależnych pomiarów. W Tabeli OR, jego SEM i 95% CI są obliczane według Altmana (odnośnik 29, MedCalc, http://www.medcalc.org/calc/odds_ratio.php). Poziom istotności wyniósł P <0,05. Zatwierdzenie badania. Badanie to zostało zatwierdzone przez lokalną Komisję ds. Oceny etycznej (Ethikkommission der. Rztekammer des Saarlandes) i przeprowadzone zgodnie z Deklaracją Helsińską. Prace rekombinacyjne DNA wykonywano za zgodą i zgodnie z przepisami władz lokalnych (Rządu Kraju Saary). Próbki krwi i tkanek od pacjentów i osób zdrowych uzyskano po uzyskaniu pisemnej, świadomej zgody. Materiały uzupełniające Przegląd danych uzupełniających Podziękowania Tę pracę wspierały stypendia Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), Sander Stiftung (organizacja charytatywna) oraz HOMFOR (grant wydziału). Dziękujemy pacjentom i ich rodzinom za udział w tym badaniu; Leon Bernal-Mizrachi, John D. Roback i Susan Sunay (cała Atlanta, Georgia, USA) za dostarczanie próbek od pacjentów afro-amerykańskich i osób zdrowych; i Shinsuke Iida, Yoshiaki Kuroda, Akira Sakai i Ryuzo Ueda za dostarczenie próbek od japońskich pacjentów i zdrowych osób kontrolnych. Przypisy Konflikt interesów: Autorzy zadeklarowali brak konfliktu interesów. Informacje referencyjne: J Clin Invest. 2015; 125 (1): 316. 323. doi: 10.1172 / JCI76802. Zobacz powiązany artykuł na stronie. [hasła pokrewne: centrum pszczelarskie łysoń, sklep pszczelarski łysoń, łysoń sklep ] [patrz też: przeszczep szpiku kostnego, gorvita zielony jęczmień opinie, łysoń sklep ]