Sumoilated HSP90 jest dominującym czynnikiem dziedziczącym ryzyko dyssypcji komórek plazmatycznych ad

Eksperymenty Western blot i ELISA ujawniły, że pełna krew od wszystkich pacjentów z MGW / MM / Waldenstromem z makroglobulinemią (WM) z paraproteiną anty-HSP90-SUMO1 wyrażała zarówno sumoilowany HSP90 i WT HSP90, podczas gdy HSP90-SUMO1 nie był obserwowany u pacjentów, których paraproteina nie wiązały się z HSP90-SUMO1 (Figura i dane nie pokazane). Natomiast 5/550 (0,9%) europejska, 2/100 (2%) afroamerykańska i 2/278 (0,8%) japońska grupa kontrolna niosła HSP90-SUMO1, co dawało iloraz szans (OR) (określony przez analiza regresji jednozmienn. w SPSS) 14,8 dla Europy, 6.2 dla Afroamerykanów i 7,4 dla japońskich zdrowych nosicieli dla MGUS / MM / WM. Figura HSP90-SUMO1 u pacjentów i u zdrowych dawców. Western blot (ścieżki 1. 6) lub immunoprecypitację (ścieżki 7. 10) lizatów komórek krwi pochodzących od pacjentów i zdrowych dawców. HSP90-SUMO1 wykryto tylko u pacjentów immunopozytywnych. Ścieżki 1. 3: 3 zdrowych dawców; ścieżka 4: pacjent z paraproteiną o innej swoistości; ścieżki 5 i 6: 2 pacjentów z immunoreaktywnością przeciwko HSP90-SUMO1. Lizat komórek krwi z linii 7 reprezentuje pacjenta z paraproteiną o innej swoistości; ścieżka 8 przedstawia pacjenta z immunoreaktywnością względem HSP90-SUMO1. Obie próbki poddano immunoprecypitacji mAb anty-HSP90, rozdzielono metodą SDS-PAGE i wykryto anty-HSP90. Ścieżki 9 i 10: takie same jak w ścieżkach 7 i 8, ale wykrywanie za pomocą anty-SUMO1; ścieżki 11 i 12: takie same jak w ścieżkach 7 i 8, ale wykrywanie za pomocą anty-SUMO2 / 3. Tabela Immunoreaktywność HSP90-SUMO1 i stan nosicielski w różnych grupach etnicznych Epitop wiążący przeciwciała HSP90-SUMO1. Według analizy in silico przewidziano 17 możliwych miejsc sumoilacji dla HSP90 (SUMOplot Analysis Program, http://www.abgent.com/tools/), z których 5 ma wysokie prawdopodobieństwo; 4 z nich znajdowały się w częściowym klonie HSP90-SUMO1, za pomocą którego wykryto paraproteiny reagujące z HSP90-SUMO1 (3. W celu zidentyfikowania lizyny i epitopu, które, gdy sumoilowano, związały odpowiednie paraproteiny, przeprowadzono ukierunkowaną mutagenezę. Dopiero po zastąpieniu HSP90 K559 przez argininę (K559R) nie wykryto reaktywności surowicy HSP90-SUMO1, podczas gdy zastąpienie K186R, K438R i K685R (samodzielnie lub w połączeniu) nie miało wpływu na wiązanie reaktywnych paraprotein (Figura 2) lub Pochodzący z receptora komórkowego B (pochodzący z BCR) fragment wiążący antygen (Fab, Suplementowa Figura 3), co wskazuje, że immunoreaktywność paraproteiny była specyficzna dla gałęzi HSP90-SUMO1 przy K559 (HSP90-SUMO1K559). Wszystkie reaktywne paraproteiny HSP90-SUMO1 . związane z tym samym epitopem HSP90-SUMO1K559. Figura 2 Identyfikacja immunogennego miejsca sumoylowania HSP90. Wysoce przewidywane miejsca sumoilacji HSP90 były pojedynczo lub potrójnie zmutowane, jak wskazano i przetestowane pod kątem immunoreaktywności u pacjentów. surowice (rozcieńczenie 1: 107) za pomocą testu ELISA. (A) Weryfikacja mutacji za pomocą analizy Western blot przy użyciu mAb anty-HSP90 lub anty-SUMO. (B) ELISA: Jako przykład przedstawiono immunoreaktywność surowicy jednego pacjenta względem zmutowanego i sumoilowanego HSP90. Surowica pacjenta nie reagowała z WT HSP90 lub HSP90-SUMO1 (K559R), podczas gdy wszystkie inne mutacje nie wpływały na odpowiedzi immunologiczne. (C) ELISA: wszystkie surowice pochodzące od wszystkich 27 pacjentów HSP90-SUMO1. Immunopozytywnych nie wykazywały immunoreaktywności po zastąpieniu K559 przez argininę (K559R), która nie ma odpowiedniego miejsca sumoilacji. Wszystkie inne mutacje nie miały wpływu na immunoreaktywność. Każda kolumna reprezentuje indywidualnego pacjenta HSP90-SUMO1-dodatniego. Wykazanie pochodzenia parabrotein HSP90-SUMO1 pochodzenia monoklonalnego BCR. Reakcję, w której pośredniczy paraproteina wobec HSP90-SUMO1, wykazano przez klonowanie BCR z rozmazu szpiku kostnego (naciek komórek plazmatycznych około 80%) pacjenta z paraproteiną specyficzną wobec anty-HSP90-SUMO1a. Geny Ig (VH, V ., V.) Scharakteryzowano metodą PCR i klonowano do wektora fagmidowego w celu wytworzenia Fab. Zarówno Fab pochodzący z BCR jak i paraproteina rozpoznawały HSP90-SUMO1 jako cel (Figura 3), a paraproteina pacjenta wypierała rekombinowany Fab pochodzący z BCR w sposób zależny od dawki (Figura 3C) w teście konkurencji, pokazując, że zarówno rekombinowany Fab, jak i paraproteina wiążą się z tym samym epitopem HSP90-SUMO1. Figura 3 Specyficzność paraprotein swoistych dla receptora antygenowego komórek plazmatycznych (pochodzących od BCR) Fab i HSP90-SUMO1a za pomocą testu ELISA. P549 reprezentuje reaktywną paraproteinę HSP90-SUMO1, podczas gdy P69 jest paraproteiną o specyficzności dla paratarg-7. (A) Reaktywność. (B) Specyfika. Sumoilowane białko zawierające walosynę (VCP) (CDC48) jako kontrola dla WT SUMO
[patrz też: podchloryn sodu dawkowanie, łysoń sklep, sprzęt pszczelarski łysoń ]
[patrz też: sklep pszczelarski łysoń, bartnik bielsko, przychodnia bielsko komorowicka ]