Trostostymina, heterodimer dwóch nowych ludzkich podjednostek hormonu glikoproteinowego, aktywuje receptor hormonu tarczycy ad 5

Analiza immunoblotowa A2 i B5 w przednim płacie przysadki szczura. Do analizy użyto ekstraktów przysadki mózgowej. Niektóre próbki wstępnie traktowano N-glikozydazą F. (d) Immunobarwienie A2 i B5. Przedni przysadka wykazał pozytywne wybarwienie przy użyciu przeciwciał A (B lub A5 (górny panel), podczas gdy surowica przed immunizacją była nieskuteczna. Przeprowadzono podwójnie fluorescencyjne barwienie immunologiczne stosując Ab B5, a następnie skoniugowany z fluoresceiną fragment AffiniPure Fab, kozie anty-królicze IgG (środkowy panel). Następnie, tę samą sekcję inkubowano z A2 Ab, a następnie sprzężoną z Texam czerwoną barwnikiem. AffiniPure kozie anty-królika nienaruszoną IgG. Obrazy dla A2 (czerwony) i B5 (zielony) zostały połączone (żółte), aby pokazać koekspresję tych dwóch podjednostek. Jako kontrola negatywna, pominięcie A2 Ab nie doprowadziło do sygnałów pochodzących z czerwonego barwnika Texas (dane nie pokazane). Stosując podejście podwójnie immunobarwienia, stwierdzono brak koekspresji między A2 (czerwony) i ACTH, hormonem wzrostu (GH), prolaktyną (PRL), LH-a lub TSH-a. (wszystko na zielono, środkowe i dolne panele). Następnie wygenerowaliśmy specyficzne Ab na A2 i B5 w celu wykrycia ekspresji tych białek. W immunoblotach w warunkach redukujących (fig. 2b), specyficzne abpy A2 i B5 nie reagowały krzyżowo z czterema znanymi hormonami glikoproteinowymi, ale wykryły prążki w przybliżeniu 23 i 20 kDa w kondycjonowanych pożywkach transfekowanych komórek, odpowiadających A2 i Podjednostki B5, odpowiednio. Wstępne badanie tkanek eksprymujących transkrypty A2 i B5 wskazało, że przedni przysadka miał wysoki poziom immunoreaktywności, podczas gdy mózg, tarczycy i jajnik nie wykazywały obu antygenów w tym samym typie komórek. Jak pokazano na Figurze 2c, zarówno immunoreaktywności A2, jak i B5 można było wykryć w przednim płacie przysadki szczura, stosując analizę immunoblot. Największe pasma 23 i 20 kDa znaleziono odpowiednio dla A2 i B5. Po traktowaniu N-glikozydazą F wykryto prążki o niższej masie cząsteczkowej, zgodne z naturą glikoproteiny tych białek podjednostek. Następnie przeprowadziliśmy barwienie immunohistochemiczne A2 i B5. Jak pokazano na ryc. 2d (górny panel), zarówno immunoreaktywności A2, jak i B5 stwierdzono w przednim płacie przysadki szczura. Aby zweryfikować koekspresję podjednostek A2 i B5, przeprowadzono podwójnie fluorescencyjne barwienie immunologiczne. Jak pokazano na rysunku 2d (środkowy panel), wiele komórek eksprymowało zarówno antygeny A2, jak i B5 w przednim przysadce mózgowej. Chociaż nie zidentyfikowano specyficznego typu koeksprymującego komórki A2 i B5, komórki A2-dodatnie nie wykazywały kosztów związanych z ACTH, hormonem wzrostu, prolaktyną LH-a lub TSH-y. (Rysunek 2d, środkowy i dolny panel). W celu dalszej analizy natury biochemicznej i bioaktywności zrekombinowanych białek A2 / B5, kondycjonowane pożywki z komórek 293T eksprymujących heterodimer A2 / B5 przepuszczono przez kolumnę do wymiany kationów Mono-S. Jak pokazano na Figurze 3a, główny pik białka wymyto pomiędzy 30. 35% M NaCl. Frakcje te zawierały wysokie poziomy podjednostek A2 i B5 w immunoblotach (górny panel) i wykazywały aktywność stymulującą receptor TSH (dane nie pokazane). Natomiast frakcje i 55 nie zawierały wykrywalnych podjednostek A2 lub B5. Szczytowe frakcje (frakcje 30-38) zatężono i przepuszczono przez kolumnę frakcjonującą o rozmiarze Superdex G-75 przed monitorowaniem bioaktywności w oparciu o stymulację wytwarzania cAMP przez komórki 293T wyrażające ludzkie receptory TSH (Figura 3b, linia przerywana). Ponownie, szczyt aktywności stymulacji receptora TSH zbiegł się z frakcjami zawierającymi zarówno prążki A2 i B5 w immunoblotach (Figura 3b, górny lewy panel). Mol wagowy bioaktywnych białek w tych frakcjach oszacowano na 43 kDa w oparciu o markery mol wag. Barwienie srebrem połączonych frakcji szczytowych po SDS-PAGE dodatkowo wskazało oczyszczanie kompleksu złożonego z podjednostek A2 i B5 (Figura 3b, prawy górny panel). Opierając się na właściwościach stymulujących tarczycę, oczyszczone białko heterodimeryczne nazwano thyrostimuliną, aby odróżnić go od znanego hormonu tarczycy, TSH. Chociaż podjednostki tyreparymuliny zdysocjowane w nieredukcyjnej SDS-PAGE (dane niepokazane), wykryliśmy obecność kompleksów o wysokiej masie cząsteczkowej odpowiadających wielkości przewidywanego heterodimeru po sieciowaniu oczyszczonego białka A2 / B5 (Figura 3c, prawy górny panel ). Charakter glikoproteinowy tyreostatimuliny był dalej testowany przez traktowanie oczyszczonego heterodimeru N-glikozydazą F, a następnie immunoblotting. Jak pokazano na Figurze 3c (dolny panel) obserwowane zmniejszenie wielkości podjednostek A2 i B5 jest zgodne z obecnością N-połączonych miejsc glikozylacji w tych peptydach (Asn 14 i 58 w A2, Asn 63 w B5). W komórkach eksprymujących rekombinowane ludzkie receptory TSH stwierdzono, że oczyszczona tyrostatimina jest tak samo silna jak bydlęca TSH i silniejsza niż ludzka TSH w stymulowaniu wytwarzania cAMP (Figura 4a, lewy panel).
[patrz też: finasteryd skutki uboczne, centrum pszczelarskie łysoń, objawy refluksu u dzieci ]
[więcej w: płatki owsiane na wodzie, podchloryn sodu dawkowanie, wrzodziejące zapalenie jelita grubego dieta ]