Trostostymina, heterodimer dwóch nowych ludzkich podjednostek hormonu glikoproteinowego, aktywuje receptor hormonu tarczycy cd

Supernatant naniesiono na kolumnę kationowymienną Mono S HR10 / 10 (Amersham Pharmacia Biotech) w 4 ° C (20 mM kwas 2- [N-morfolino] etanosulfonowy, pH 6,6), a frakcje szczytowe zastosowano do immunoblottingu w celu wykrycia frakcji z antygenem A2 i B5. Pozytywne frakcje następnie dializowano wobec PBS i zatężono przed naniesieniem na kolumnę Superdex G75 w celu frakcjonowania wielkości i określenia aktywności biologicznej. Czystość heterodimeru A2 / B5 potwierdzono przez barwienie srebrem po SDS-PAGE, a oznaczenie ilościowe oczyszczonego A2 / B5 oparto na teście Bradforda (BioRad Laboratories Inc., Hercules, California, USA). Z powodu niestabilności dimeru A2 / B5 podczas SDS-PAGE, tworzenie dimeru zweryfikowano za pomocą analizy sieciowania. Oczyszczone kompleksy B5 i A2 sieciowano z zastosowaniem mM suberatu didukcynimidylowego (DSS) (Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois, USA) przez 30 minut, i reakcję zakończono przez dodanie M Tris-HCl, pH 7.4. Usieciowane kompleksy monitorowano przy użyciu SDS-PAGE (10%) w warunkach obniżonych. Charakter glikoproteiny A2 / B5 potwierdzono przez traktowanie oczyszczonych heterodimerów N-glikozydazą F (New England Biolabs Inc., Beverly, Massachusetts, USA) przed SDS-PAGE. Ocena aktywności stymulującej tarczycę in vitro i in vivo. Komórki 293T transfekowano plazmidami kodującymi cDNA ludzkiego TSH, LH lub receptora FSH (16, 17) i inkubowano w pożywce DMEM / F12 uzupełnionej mg / ml BSA i 0,25 mM IBMX z lub bez A2 / B5, bydlęcej TSH. ludzki TSH (Genzyme Transgenics Corp., Framingham, Massachusetts, USA) lub gonadotropiny. Po 16 godzinach od inkubacji oznaczono wytwarzanie cAMP przy użyciu specyficznego testu radioimmunologicznego (18). Aby wykazać specyficzność stymulujących efektów A2 / B5, próbki inkubowano wstępnie z surowicami odpornościowymi przeciwko A2 lub B5 lub surowicy przed immunizacją, przez godzinę przed dodaniem do hodowanych komórek. W przypadku testów na receptorach radioligandów bydlęcy TSH znakowano stosując Jodogen (Pierce Chemical Co.). Komórki 293T trwale eksprymujące ludzkie receptory TSH typu dzikiego inkubowano z TSH znakowanym I125 (10000 cpm / probówkę) z lub bez nieznakowanego TSH lub A2 / B5 w buforze wiążącym 300 (1 (HBSS, 280 mM sacharoza i 0,5% BSA). . Po inkubacji przez 3 godziny w 23 ° C, komórki przemyto dwukrotnie i odwirowano przed zliczeniem radioaktywności w peletce za pomocą licznika gamma. Zdolność A2 / B5 do regulowania funkcji tarczycy testowano przy użyciu testów in vitro (19) i in vivo (20). Klonalne komórki tarczycy tarczycy FRTL5 utrzymywano w zmodyfikowanej Coon. S pożywce Ham F12 zawierającej 5% surowicę cielęcą przed traktowaniem testowymi hormonami przez 16 godzin w celu pomiaru zawartości cAMP przy użyciu specyficznego testu radioimmunologicznego. Testy do wbudowania 3H-tymidyny przeprowadzono na monowarstwie subkonfluentnych komórek FRTL5. Cztery dni przed oznaczeniem zmieniono pożywkę na pożywkę bez surowicy zawierającą 0,1% BSA. Komórki następnie traktowano testowymi hormonami przez 20 godzin przed dodaniem 3H-tymidyny. Po 4 godzinach inkubacji komórki przemyto dwukrotnie buforem i trzy razy oziębionym lodem kwasem trichlorooctowym. Osad następnie solubilizowano w 500 .l 0,2 M NaOH i zobojętniono 50 .l lodowatego kwasu octowego przed pomiarem radioaktywności. W teście biologicznym TSH in vivo, 50-dniowym samcom szczurom podawano trijodotyroninę (3 .g / ml) w wodzie do picia przez 4 dni (20) w celu stłumienia endogennego wydzielania TSH. Zwiększone dawki rekombinowanego A2 / B5 lub bydlęcego TSH wstrzyknięto dootrzewnowo, a próbki krwi uzyskano 6 godzin później. Oznaczenie stężenia tyroksyny (T4) w surowicy mierzone za pomocą testu radioimmunologicznego (Diagnostic Systems Laboratories Inc., Webster, Texas, USA) służyło jako punkt końcowy testu. Wyniki Sekwencje ludzkiego B5 i A2 porównano z ludzkim TSH-a. i często. podjednostkę, odpowiednio (ryc. 1a). Mimo że w sekwencji B5 brakuje pasa bezpieczeństwa C-terminal. region, wszystkie reszty cysteiny potrzebne do tworzenia węzłów cystynowych są zachowane. Ponieważ nowo zidentyfikowane. podjednostka A2 prawdopodobnie łączy się ze znaną lub nową powieścią. podjednostki do tworzenia bioaktywnych heterodimerycznych hormonów, przetestowaliśmy potencjalne interakcje pomiędzy różnymi parami genów podjednostek przy użyciu dwuhybrydowego testu drożdżowego. Jak pokazano na Figurze 1b, stwierdzono silne interakcje między podjednostką A2 i B5, CG-p lub FSH-a. Jednakże stwierdzono minimalne interakcje między A2 i LH-a. lub TSH-y. Na podstawie tych wyników skonstruowaliśmy dwa plazmidy promotorowe kodujące różne pary podjednostek i przetestowaliśmy ich potencjalną aktywację ludzkich gonadotropin i receptorów TSH. Interesujące jest to, że kondycjonowane pożywki komórek 293T transfekowanych cDNA kodującym parę A2 / B5 były zdolne do stymulowania wytwarzania cAMP przez komórki wyrażające receptory TSH (patrz Figura 3 i Figura 4, opisane poniżej). Figura 1: Identyfikacja A2 i B5 jako potencjalnych partnerów heterodimeryzacji
[więcej w: wrzodziejące zapalenie jelita grubego dieta, przeszczep szpiku kostnego, bartnik bielsko ]
[podobne: operacje plastyczne dr szczyt, finasteryd skutki uboczne, dom latających sztyletów cda ]