Trostostymina, heterodimer dwóch nowych ludzkich podjednostek hormonu glikoproteinowego, aktywuje receptor hormonu tarczycy czesc 4

Porównanie sekwencji między ludzkim B5 i TSH-a a także A2 i wspólne. podjednostka (A). (b) Drożdżowe dwuhybrydowe analizy oddziaływań między A2 i różnymi genami podjednostek w rodzinie hormonów glikoproteinowych. Komórki drożdży transfekowano plazmidami kodującymi A2 i różne geny podjednostek poddane fuzji z domeną aktywującą GAL4 i domeną wiążącą, odpowiednio. Wyraźny wzrost kolonii wyrażających A2 i B5 wskazuje na silne oddziaływanie między tymi białkami. Zaobserwowano również interakcje między A2 i CG-a, a także A2 i FSH-a, podczas gdy nie znaleziono wzrostu kolonii drożdży w komórkach eksprymujących tylko A2, co wyklucza samo-aktywację tych konstruktów. Figura 3 Oczyszczanie heterodimeru A2 / B5 i charakterystyka jego natury glikoproteinowej. (a) Izolacja A2 / B5 z zastosowaniem kolumny kationowymiennej Mono-S. Kondycjonowane pożywki z komórek 293T eksprymujących heterodimery A2 / B5 zatężono przed frakcjonowaniem z użyciem kolumny Mono-S. Próbki eluowano stosując gradient NaCl. Immunoreaktywne A2 i B5 monitorowano za pomocą immunoblot (górny panel) w wybranych frakcjach (dolny panel, grube słupki). (b) Dalsze oczyszczanie dimeru A2 / B5 przy użyciu kolumny Superdex G-75 i jej stymulacja receptorów TSH. Szczytowe frakcje z kolumny Mono-S dalej analizowano stosując kolumnę do sortowania Superdex. Aktywność stymulującą receptor TSH monitorowano w oparciu o wytwarzanie cAMP przez komórki wyrażające rekombinowane ludzkie receptory TSH (linia przerywana). Poziomy A2 i B5 w szczytowych frakcjach monitorowano immunoblotami (górny lewy panel) i srebrem (górny prawy panel). (c) Heterodimeryzacja rekombinowanego A2 / B5 w oparciu o analizę sieciowania i naturę glikoproteiny heterodimeru A2 / B5. Szczytowe frakcje kolumny Superdex zawierającej oczyszczone B5 i A2 usieciowano stosując mM DSS (górny prawy panel) lub traktowano N-glikozydazą F (dolny panel) przed SDS-PAGE i immunoblotting w warunkach denaturujących. Górny lewy panel pokazuje próbki bez wstępnej obróbki DSS. Figura 4 Działanie stymulujące tarczycę oczyszczonego heterodimeru A2 / B5. (a) Oczyszczone A2 / B5, takie jak TSH, stymulowało produkcję cAMP, w której pośredniczą ludzkie receptory TSH, ale nie receptory LH i FSH. Zależne od dawki działanie A2 / B5 i innych hormonów (lewy panel). b, bydło; hrec, rekombinant ludzki; h, człowiek. Brak stymulacji receptorów LH i FSH przez A2 / B5 (prawy panel). Ludzki CG lub FSH (100 ng / ml) zastosowano jako kontrole pozytywne (prawy panel). (b) Zdolność specyficznych Ab do A2 lub B5 (rozcieńczenie 1: 100) w celu zneutralizowania działania stymulującego A2 / B5 (0,3 ng / ml) na wytwarzanie cAMP, w którym pośredniczą receptory TSH. Dodanie surowicy preimmunizacyjnej nie wpłynęło na stymulujące działanie A2 / B5. Ponadto wstępne traktowanie surowic odpornościowych A2 i B5 nie wpłynęło na produkcję cAMP indukowaną przez ludzki TSH (3 ng / ml). (c) Przemieszczenie znakowanego bydlęcego TSH z rekombinowanych ludzkich receptorów TSH przez A2 / B5. Ludzki CG został włączony jako kontrola negatywna. (d) Oczyszczone A2 / B5 (100 ng / ml) promowało wytwarzanie cAMP i włączanie tymidyny przez hodowane komórki FRTL5 szczura tarczycy in vitro. bTSH, bydlęcy TSH (100 ng / ml). (e) indukcja produkcji T4 przez gruczoł tarczowy A2 / B5 u myszy leczonych trijodotyroniną (T3) w celu stłumienia endogennych poziomów TSH. Każdy punkt danych reprezentuje średnią. SE z trzech do czterech oznaczeń o podobnych wynikach uzyskanych w co najmniej trzech oddzielnych eksperymentach. Aby wykryć ekspresję A2 i B5 w różnych tkankach, przeprowadzono analizę RT-PCR w celu identyfikacji tkanek szczurów eksprymujących zarówno A2, jak i B5. Jak pokazano na ryc. 2a, transkrypt A2 zgodny z oczekiwanym rozmiarem 208 pz można było wykryć w różnych tkankach, podczas gdy komunikat B5 o spodziewanym rozmiarze 346 pz znaleziono tylko w mózgu, przednim płacie przysadki, tarczycy, jajowodzie i sercu . Zastosowane startery nie obejmowały intronu, a tożsamość produktów PCR potwierdzono przez bezpośrednie sekwencjonowanie. Pominięcie mRNA w reakcji RT-PCR nie dało żadnego produktu. Figura 2 Ekspresja mRNA A2 i B5 w tkankach szczurów i immunoanalizach A2 i B5 w przednim przysadce mózgowej. (a) Analiza RT-PCR transkryptów A2 i B5 w tkankach szczura. Wzmocnienie poziomów wiadomości GAPDH odzwierciedla różnice w obciążeniu cDNA. (b) Hormonalna specyficzność Ab na A2 i B5. Analiza immunoblottingu wykazała, że Abs przeciwko A2 lub B5 rozpoznawało białka wydzielane przez komórki 293T transfekowane plazmidami ekspresyjnymi kodującymi A2 lub B5 lub A2 i B5. Jednakże nie można było znaleźć sygnału w ścieżkach obciążonych 500 ng rekombinowanego ludzkiego (h) CG, LH, FSH lub TSH. Stwierdzono, że niższe pasmo w immunoblot A2 jest niespecyficzne
[przypisy: płatki owsiane na wodzie, bartnik bielsko, sklep pszczelarski łysoń ]
[patrz też: depilacja brazylijska poznań, czym słodzić zamiast cukru, jak zakończyć karmienie piersią ]