Wrodzony niedobór sucrase-izomaltazy powstały w wyniku cięcia i wydzielania zmutowanej postaci enzymu ad 5

Skalowane pręty: 0,1 .m. Izolacja cDNA SI z tkanki pacjenta i identyfikacja mutacji punktowej odpowiedzialnej za fenotyp CSID. Normalne syntetyczne poziomy SI w próbce biopsyjnej pacjenta i zmienione posttranslacyjne zachowanie silnie potwierdziły pogląd, że mutacja lub delecja w regionie kodującym genu SI była odpowiedzialna za generowanie tego fenotypu SI. Izolacja cDNA SI umożliwiłaby zatem identyfikację zmian w cDNA prawdopodobnie odpowiedzialnym za ten fenotyp. Ponadto, ekspresja cDNA w heterologicznym systemie transfekcji pomoże zidentyfikować etapy przetwarzania i handlu pro-SI, które były niemożliwe do wykonania z powodu ograniczenia tkanki; w ten sposób wytyczono by istotne szczegóły molekularnej podstawy tego nowego fenotypu. Aby wyizolować cDNA SI, zastosowaliśmy strategię zasadniczo podobną do strategii stosowanej przy pierwszej identyfikacji mutacji w fenotypie CSID (11). Produkty dwóch niezależnych reakcji PCR wklonowano do wektora pCR 2.1 i zsekwencjonowano z flankującymi miejscami Wszechświata M13 i odwrotnego startera w wektorze. Analiza sekwencji ujawniła jedną zmianę w stosunku do sekwencji typu dzikiego (22). Ta zmiana, T / C przy nukleotydzie 1021, została znaleziona w sekwencji kodującej podjednostkę izomaltazy kompleksu pro-SI i spowodowała substytucję leucyny (3 proliny przy reszcie aminokwasowej 340 (L340P). Sekwencjonowanie kilku niezależnych produktów PCR potwierdziło obecność tej jednopunktowej mutacji w cDNA pacjenta. Sekwencja typu dzikiego nigdy nie mogła zostać zidentyfikowana, co sugeruje, że oba allele genu SI zawierały tę mutację lub, co bardziej prawdopodobne, że allel typu dzikiego nie był eksprymowany. Przejściowa ekspresja zmutowanego cDNA SI w komórkach ssaków i charakteryzowanie biosyntezy, przetwarzania, fałdowania i funkcji zmutowanego pro-SI. Chcieliśmy następnie ustalić, czy podstawienie L340P było podstawową przyczyną zmienionego posttranslacyjnego przetwarzania pro-SI w nowym fenotypie. W tym celu wprowadziliśmy tę mutację do cDNA SI typu dzikiego, stosując mutagenezę ukierunkowaną na oligonukleotyd. Powstały mutant następnie analizowano w przejściowo transfekowanych komórkach MDCK. Figura 4a pokazuje immunoprecypitowany zmutowany pro-SI z transfekowanych komórek, które zostały poddane protokołowi znakowania impulsów. We wczesnych punktach pościgu, pro-SI wyizolowany z lizatów komórkowych miał wzór pasmowy podobny do tego, który stwierdzono w ekstraktach detergentowych próbki biopsyjnej. Pro-SI był wrażliwy na Endo H i przesunięty do podwójnego pasma o nieznacznie różniących się masach cząsteczkowych. Po godzinie pościgu, bogaty w mannozę pro-SI został wykryty i został rozwiązany, jak w poprzednim punkcie czasowym, w dublet. Dodatkowo, pojawiło się przeważnie oporne na Endo Hp pasmo, co wskazuje, że ta forma otrzymała złożone kompleksy glikozylowanych glikanów w aparacie Golgiego. Ta wstęga oporna na EndoH. była wydzielana do hodowli, a jej intensywność znakowania była znacznie wyższa niż w lizatach. Trzy godziny pościgu, bogaty w mannozę gatunek pro-SI nie był już rozdzielany na dublet po traktowaniu Endo H i wykryto tylko dolny prążek. Wskazuje to, że skrócona pro-SI była dominującą postacią, a jej złożona glikozylowana forma oporna na EndoH3 została znaleziona głównie w pożywce hodowlanej i ledwo była widoczna w lizatach komórkowych. Po 6 godzinach pościgu otrzymano wzór podobny do tego po 3 godzinach pościgu. Dane z analizy impulsów wykazały zatem, że skrócona forma przechodziła przez aparat Golgiego, gdzie nabyła złożone glikany i ostatecznie została wydzielona do środowiska zewnętrznego. Podobnej wydzielonej formy nie można było wykryć w komórkach kontrolnych, które transfekowano cDNA SI typu dzikiego, co zostało przewidziane, ponieważ SI jest integralnym białkiem błonowym. Wydzielony mutant pro-SI był głównie oporny na EndoH3, co wyraźnie wskazuje, że przeszedł on przez aparat Golgiego, gdzie większość N-glikanów nabyła złożony typ glikozylacji. Figura 4 Ekspresja zmutowanego cDNA SI w komórkach MDCK. (a) komórki MDCK transfekowano phSI (typu dzikiego [WT]) i pSG8-SIT / C (L340P) i znakowano biosyntetycznie za pomocą 35S-metioniny przez godzinę, a następnie przez określony czas. Lizaty komórkowe (L) i pożywki hodowlane (M) oddzielnie poddano immunoprecypitacji za pomocą mAb anty-SI. Następnie immunoprecypitaty podzielono na równe części i traktowano lub nie traktowano Endo H; analizowano je za pomocą SDS-PAGE na żelu 6% w żeliku i fluorografii. (b) komórki MDCK transfekowano pSG8-SIT / C, a 48 godzin po transfekcji znakowano je w temperaturze 15 ° C za pomocą 35S-metioniny przez 6 godzin
[przypisy: wrzodziejące zapalenie jelita grubego dieta, czym słodzić zamiast cukru, objawy refluksu u dzieci ]
[podobne: ostry dyzur okulistyczny, klinika stomatologiczna łódź, carcinoma adenoides cysticum ]