Wrodzony niedobór sucrase-izomaltazy powstały w wyniku cięcia i wydzielania zmutowanej postaci enzymu ad 6

Lizę przeprowadzono w obecności TX-114. SI poddano immunoprecypitacji z fazy wodnej (S) i detergentowej (P), potraktowano Endo H i analizowano za pomocą SDS-PAGE na żelu 6% w żelu, a następnie fluorografia. Dodatkowy prążek pojawiający się w próbkach L340P w aib jest wskazywany przez groty strzałek. W świetle danych z analizy impulsów widać, że skrócona forma pro-SI była prekursorem wydzielanych gatunków i jako taka była również białkiem hydrofilowym. Aby to potwierdzić, zbadaliśmy zdolność do ekstrakcji detergentem w TX-114 postaci pro-SI z tkanki pacjenta i kontrolnej. Figura 4b pokazuje, że skróconą postać pro-S1 bogatą w mannozę odzyskano w fazie rozpuszczalnej, podczas gdy pro-SI pełnej długości znaleziono głównie w fazie detergentu. Podobnie, bogate w mannozę pro-SI pochodzące z kontrolnej próbki znaleziono wyłącznie w fazie detergentowej. W sumie dane potwierdzają pogląd, że bogata w mannozę skrócona postać pro-SI była tak hydrofilowa jak jego wydzielony, złożony glikozylowany odpowiednik. Aby określić miejsce cięcia wewnątrzkomórkowego, znakowanie impulsowe przeprowadzono z transfekowanymi komórkami w 15 ° C. W tej temperaturze konstytutywny transport białek zostaje zablokowany w ER i ewentualnie również w ERGIC. Figura 4b pokazuje, że zmutowany dublet pro-SI był już obecny w 15 ° C, wskazując, że cięcie już wystąpiło w ER lub ERGIC. Dane z analizy impulsów wyraźnie wskazują, że skrócona forma pro-SI była cząsteczką kompetentną w transporcie. Na koniec, aby ustalić, czy wydzielona forma jest aktywna enzymatycznie, porównaliśmy jej aktywność z aktywnością pro-SI typu dzikiego. Wydzielony mutant pro-SI wyizolowano z pożywek hodowlanych, podczas gdy pro-SI typu dzikiego wyizolowano z ekstraktów detergentowych transfekowanych komórek. Aktywność sacharozowa w wydzielanej postaci wynosiła 31,2 IU, podobnie jak w przypadku SI typu dzikiego (35,6 IU). Aktywność izomaltazy była również porównywalna z jej odpowiednikiem w gatunkach typu dzikiego (28,4 w porównaniu z 25,9 IU). Należy zauważyć, że homogenaty komórkowe nie zawierały wykrywalnych aktywności sacharazy lub izomaltazy. Ponieważ wydzielana forma wyrażała normalną aktywność sucrase, a także enzymatyczną izomaltazę, doszliśmy do wniosku, że rozszczepienie wewnątrzkomórkowe zmutowanego pro-SI miało miejsce w regionie poniżej katalitycznych miejsc sucrazy i izomaltazy, które są zlokalizowane przy resztach aminokwasowych 1540 i 503 , odpowiednio. Jest to również oczywiste, gdy rozważa się wielkość wydzielanej formy, która jest zgodna z cięciem około 40 aminokwasów z pełnej długości pro-SI. W sumie podstawienie aminokwasu L340P doprowadziło do wytworzenia wydzielonej postaci pro-SI. Obecność dwóch gatunków bogatych w mannozę i związek produkt-produkt pomiędzy tymi postaciami wyraźnie wskazał, że wydzielana cząsteczka pochodziła z błony komórkowej pro-SI przez przetwarzanie wewnątrzkomórkowe w ER lub w przedgolewkowym przedziale. Dyskusja Wspólną cechą znanych fenotypów SI w CSID jest synteza normalnych poziomów enzymatycznie nieaktywnego białka, które jest blokowane wewnątrzkomórkowo lub błędnie kierowane do błony podstawno-bocznej. We wszystkich tych przypadkach SI nie jest ani dostępny, ani nie może hydrolizować swoich substratów (2. 5). Początkowo zaproponowano, że podstawą molekularną tych fenotypów są mutacje w regionie kodującym genu SI (4, 5). Eksperymentalne poparcie tej hipotezy zapewniono przez pierwszą identyfikację mutacji w cDNA SI w jednym z fenotypów CSID, mianowicie fenotypu II. W tym fenotypie, pro-SI jest blokowany wewnątrzkomórkowo w ER, ERGIC i cis-Golgi z powodu zmiany strukturalnej w podjednostce sucrazy, generowanej przez mutację, która przekształca glutaminę w prolinę przy reszcie aminokwasowej 1098 (11). Scharakteryzowana mutacja mogła wytworzyć sygnał zatrzymania w sutrze, który bierze udział w mechanizmie kontroli jakości, który działa poza ER i zapobiega przeniesieniu zmutowanej cząsteczki do miejsca jej działania. Obecne badanie opisuje molekularną i subkomórkową charakterystykę nowego fenotypu SI w CSID. Ten fenotyp nie ma wspólnych cech wcześniej badanych fenotypów, a jednak powoduje CSID. Najbardziej uderzającą i nowatorską cechą tego fenotypu jest ekspresja aktywnej enzymatycznie i kompetentnej w transporcie postaci pro-SI, która jednak nie pełni swojej normalnej funkcji w jelicie. W tym fenotypie pro-SI ulega wczesnemu wewnątrzkomórkowemu rozszczepieniu, które prowadzi do wytworzenia rozpuszczalnej, bogatej w mannozę formy, która jest kompetentna w transporcie, transponuje aparat Golgiego i jest wydzielana z komórki jako aktywna enzymatycznie cząsteczka.
[patrz też: gorvita zielony jęczmień opinie, centrum pszczelarskie łysoń, klinika stomatologiczna łódź ]
[podobne: operacje plastyczne dr szczyt, finasteryd skutki uboczne, objawy refluksu u dzieci ]