Wrodzony niedobór sucrase-izomaltazy powstały w wyniku cięcia i wydzielania zmutowanej postaci enzymu ad

Utrata zakotwiczonego pro-SI z membrany jest zatem podstawą dla CSID w tym fenotypie. Metody Przetwarzanie próbek z biopsji. CSID u dwuletniego pacjenta z kwaśną biegunką zasugerowano testem tolerancji sacharozy, podczas gdy pacjent był pod całkowitym żywieniem pozajelitowym. Kontrolną tkankę jelitową pobrano od pacjenta poddanego badaniom przesiewowym do celów diagnostycznych innych niż CSID. Trzy próbki biopsji uzyskano od każdego pacjenta i natychmiast przetworzono w następujący sposób. Jedną próbkę pocięto na małe kawałki i utrwalono pod mikroskopem immunoelektronowym. Jedna próbka została zamrożona w ciekłym azocie w celu pomiaru aktywności enzymu i przygotowania RNA. Jedna próbka została wyznakowana biosyntetycznie na płytkach do hodowli tkanek organowych, jak opisali Naim i in. (12). Izolacja i mutageneza cDNA SI. Klonowanie cDNA SI z komórek śluzówki pacjenta odbywało się zgodnie ze strategią opisaną poprzednio (11). Messenger RNA wyizolowano przy użyciu Dynabeads Oligo (dT) (Dynal, Oslo, Norwegia) i cDNA zsyntetyzowano za pomocą zestawu do syntezy cDNA First Strand (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Szwecja) stosując losowe startery nukleotydowe heksameru. Dla każdej reakcji PCR jako matrycę użyto 1/10 (2. L) mieszaniny reakcyjnej. Reakcje PCR przeprowadzono z siedmioma parami starterów opublikowanymi przez Ouwendijk i in. (11). Kontrole negatywne poddano tej samej procedurze, z tym wyjątkiem, że matrycę cDNA wyłączono z każdej mieszaniny reakcyjnej. Produkty dwóch niezależnych reakcji PCR wklonowano bezpośrednio do wektora pCR 2.1 (Invitrogen, Groningen, Holandia) i zsekwencjonowano w obu orientacjach ze starterem wszechświata M13 i primerów odwrotnych. Analiza sekwencji ujawniła pojedynczą mutację przekształcającą T w C w pozycji 1021 w produkcie obejmującym nukleotydy 652. 1366. W celu transfekcji w komórkach nerki psiej Madin-Darby (MDCK), pełny cDNA SI w wektorze plazmidowym pSG8 (phSI) (13) zmutowano w pozycji 1021 przez mutagenezę ukierunkowaną na oligonukleotyd stosując system szybkiej modyfikacji in vitro (Stratagene, La Jolla, Kalifornia, USA). W tym kontekście zastosowano następujące oligonukleotydy: SIT / strumień główny: 5 (3-TAT CAA CAG CCT GTT GGA CTA CCA GCA ATG-3. SIT / Cdownstream: 5-CAT TGC TGG TAG TCC AAC AGG CTG TTG ATA-3 .. Mutację T do C potwierdzono przez sekwencjonowanie, a uzyskany plazmid oznaczono pSG8-SIT / C. Transfekcja i metaboliczne znakowanie komórek MDCK. Komórki MDCK transfekowano za pomocą wcześniej opisanej procedury fosforanu wapnia (14). Czterdzieści osiem godzin po transfekcji, komórki MDCK znakowano biosyntetycznie za pomocą 80. Ci L- [35S] Redivue PRO-MIX (Amersham Pharmacia Biotech), jak opisali Naim i in. (15). Lizę komórek prowadzono przez godzinę w 4 ° C w buforze do lizy (25 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl, 0,5% Triton X-100, 0,5% dezoksycholanie sodu i mieszaninie inhibitorów proteazy zawierających ug / ml pepstatyny, 5 ug / ml leupeptyny, 17,4 lg / ml benzamidyny i ug / ml aprotyniny). Zwykle ml lodowatego buforu do lizy stosowano na każde 100-mm naczynie do hodowli (około 2 x 106 do 4 x 106 komórek). Immunoprecypitacja. Homogenaty biosyntetycznie znakowanych próbek biopsyjnych lub lizatów komórkowych wirowano przez godzinę przy 100 000 g w 4 ° C, a supernatanty poddano immunoprecypitacji, jak opisano w Naim i in. (8). Zastosowano cztery monoklonalne swoiste wobec epitopu przeciwciała skierowane przeciwko sacharozie, izomaltazie lub pro-SI, które wytrącają glikozylowaną wysoką mannozę (pro-SIh) i złożoną glikozylowaną (pro-SIc) postać pro-SI (16). Te produkty hybrydom HBB 1/691, HBB 2/614, HBB 2/219 i HBB 3/705 zostały hojnie dostarczone przez HP Hauri (Biozentrum, Bazylea, Szwajcaria) i EE Sterchi (Instytut Biochemii i Biologii Molekularnej, Uniwersytet Bern, Bern, Szwajcaria). Aktywności enzymatyczne. Aktywność izomaltazy i aktywności sucrazy mierzono według Dahlqvist (17), stosując jako substraty maltozę i sacharozę. SI poddano immunoprecypitacji z homogenatów biopsyjnych, ekstraktów detergentowych (pro-SIwt) lub pożywki (pro-SIsec) transfekowanych komórek MDCK i badano pod względem aktywności disacharydazy zasadniczo tak, jak opisali Naim i in. (15). Mikroskopia immunoelektronowa. Próbki biopsji zamrożono w ciekłym azocie po utrwaleniu w 5% paraformaldehydzie w 50 mM HEPES i krioprotekcji za pomocą poliwinylopirolidonu i sacharozy. Cięcie i etykietowanie ultracienkich zamrożonych skrawków przeprowadzono w sposób opisany uprzednio (18). Małe próbki tkankowe podzielono na skrawki kriogeniczne z Leica EM ULTRACUT RFCS (Leica, Bensheim, Niemcy) w temperaturze od około 100 ° C do około 110 ° C. Rozmrożone sekcje inkubowano przez 45 minut z poliklonalnym przeciwciałem anty-SI (19) i na koniec z kozim immunoglobuliną przeciwkróliczą (Dianova, Hamburg, Niemcy) w temperaturze pokojowej.
[patrz też: operacje plastyczne dr szczyt, czym słodzić zamiast cukru, sprzęt pszczelarski łysoń ]
[hasła pokrewne: gorvita zielony jęczmień opinie, łysoń sklep, sklep łysoń ]