Wrodzony niedobór sucrase-izomaltazy powstały w wyniku cięcia i wydzielania zmutowanej postaci enzymu cd

Siatki kontrastowano z octanem uranu, zatopiono w 2% metylocelulozie (1 ml metylocelulozy zawierało 0,1 ml 3% octanu uranu) i zbadano w mikroskopie elektronowym Phillips 400 (Phillips, Eindhoven, Holandia). Inne procedury. Trawienie znakowanych 35S immunoprecypitatów endo-P-N-acetyloglukozaminidazą H (Endo H) i endo-P-N-acetyloglukozoaminidazą F / glikopeptydazą F (Endo F / GF) przeprowadzono w sposób opisany uprzednio (15). Ekstrakcję Triton X-114 (TX-114) przeprowadzono zasadniczo jak opisano w Wilson i in. (20). SDS-PAGE przeprowadzono zgodnie z Laemmli (21). Jako referencje masy cząsteczkowej stosowano znaczniki o wysokiej masie cząsteczkowej od Sigma Aldrich (Deisenhofen, Niemcy). Wyniki Ocena CSID. Test tolerancji na sacharozę początkowo sugerował, że pacjent cierpiał na złe wchłanianie sacharozy. Zostało to potwierdzone przez pomiar aktywności enzymatycznej sacharazy i izomaltazy w homogenatach próbki biopsyjnej. Kontrola wykorzystywała inną disacharydazę, hydrolazę laktazy-floryzyny (LPH). Podczas gdy aktywność LPH była w normalnym zakresie (16. 32 IU / mg białka), aktywność sacharazy i izomaltazy była poniżej poziomów wykrywania, wskazując na defekt enzymatyczny ograniczony do SI. Biosynteza, przetwarzanie i subkomórkowa lokalizacja SI w tkance pacjenta. Aby ustalić, czy ten niedobór jest wynikiem zmienionego posttranslacyjnego przetwarzania lub bloku w transporcie pro-SI wzdłuż szlaku sekrecyjnego, przeanalizowaliśmy strukturalne cechy pro-SI w biosyntetycznie wyznakowanej próbce biopsyjnej pacjenta. Schematyczny rysunek struktury i połączenia błony pro-SI pokazano na Figurze 1. Immunoprecypitacja SI z ekstraktów detergentowych znakowanej tkanki ujawniła pasmo białka o pozornej masie cząsteczkowej 210 kDa. Ten zespół miał nieco rozproszony wzór, gdy był bezpośrednio porównywany z jego odpowiednikiem w biopsji kontrolnej (Figura 2a). Obserwacja ta sugerowała obecność różnych glikozylowanych form tego samego polipeptydu lub, alternatywnie, polipeptydów o różnych rozmiarach. Leczenie Endo H, które rozszczepia glikany bogate w mannozę, rozwiązało pro-SI pacjenta na dwa określone polipeptydy o nieco innych pozornych masach. Z drugiej strony, kontrola pro-SI została przeniesiona do pojedynczego polipeptydu (185 kDa) w podobnych warunkach leczenia. Porównanie preparatów Endo H ujawniło, że górny prążek dubletu w pro-SI pacjenta miał podobną pozorną masę cząsteczkową do tej z produktu o masie cząsteczkowej 185 kDa z gatunku kontrolnego (Figura 2b). Czułość Endo H polipeptydu 210 kDa jest kompatybilna z glikozylacją bogatego w mannozę pro-SI, jak również z lokalizacją ER. Ponieważ dwa polipeptydy w tkance pacjenta, w porównaniu z jednym w kontroli, zostały wygenerowane po N-deglikozylacji, doszliśmy do wniosku, że mniejsze pasmo Endo H odpowiada skróconej formie pełnej długości bogatych w mannozę gatunków pro-SI. Po 4 godzinach oznaczania tętna nie obserwowano zmian wzorca elektroforetycznego w pro-SI pacjenta w porównaniu z poprzednim punktem czasowym. Podobnie utrzymano wzór wrażliwości Endo H tego pasma białka. Przeciwnie, próbka z biopsji kontrolnej ujawniła, w podobnym punkcie czasowym znakowania, złożoną, glikozylowaną i dojrzałą postać EndoH2 o 245 kDa (Figura 2b), przypominającą przetwarzanie i dojrzewanie w aparacie Golgiego przed nakierowaniem na błonę wierzchołkową ( 8). Jest zatem oczywiste, że nieprawidłowości w posttranslacyjnym przetwarzaniu normalnie syntetyzowanego białka pro-SI wystąpiły w próbce pacjenta. Aby zbadać, czy te zmiany były ograniczone do pro-SI lub były spowodowane ogólnym defektem komórkowym, zbadano biosyntezę innych enzymów granicznych kontrolnych szczotek. LPH i aminopeptydazę N (ApN) zostały zsyntetyzowane i przetworzone w złożone glikozylowane gatunki w komórkach jelit pacjenta, podobnie jak komórki kontrolne, wykluczając w ten sposób ogólny defekt komórkowy jako podstawową przyczynę nieprawidłowej biosyntetycznej ścieżki pro-SI (rysunek 2c) (12). Rysunek Struktura i orientacja membrany pro-SI. (a) Strukturalne cechy pro-SI wywnioskowane z badań biosyntetycznych (8) i klonowania cDNA (6). Pro-SI to glikoproteina błonowa typu II (Nin / Cout) syntetyzowana z nie dającą się rozdzielić sekwencją sygnałową, która służy również jako domena zakotwiczająca w błonie (6). Ogon cytoplazmatyczny zawiera 12 reszt aminokwasowych, po których następuje zakotwiczenie błonowe o 20 aminokwasach i bogata w Ser / Thr domena zrębowa o 28 aminokwasach, uważana za część podjednostki izomaltazy.
[przypisy: depilacja brazylijska poznań, finasteryd skutki uboczne, łysoń sklep ]
[patrz też: bartnik pl, sprzęt pszczelarski łysoń, centrum pszczelarskie łysoń ]